乳腺癌中靶向抑制REST協阻抑制因子3表達的微小RNA的預測及其高通量數據驗證▲

陳文艷 杜欣娜 樊偉平 莊 瑩 趙小芳 孫海燕 張 虎

(江蘇醫藥職業學院1 基礎醫學部，2 護理學院，鹽城市 224005，電子郵箱：18261908663@163.com)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，其發病率逐年上升，且具有年輕化的趨勢，嚴重威脅女性健康，影響生活質量[1]。本課題組在前期研究中發現，REST協阻抑制因子3(REST corepressor 3，RCOR3)基因高表達的乳腺癌患者預后相對好，可作為乳腺癌預后預測的潛在標志物。基因表達受多種因素的影響，如基因拷貝數變化、DNA甲基化修飾、組蛋白乙酰化等修飾、轉錄因子和非編碼RNA等[2-3]。微小RNA(microRNA，miRNA)作為一種普遍存在的靶向抑制基因表達的非編碼RNA，可以調控人類1/3的基因表達。MiRNA因具有腫瘤細胞增殖、轉移、凋亡和耐藥等重要生物學功能而成為腫瘤基因治療的潛在靶點[4-5]。通過軟件預測和高通量數據驗證可以快速找到靶向調節基因表達的miRNA，而通過后續細胞和分子生物學實驗驗證，可以進一步加速揭示基因表達調控機制，為腫瘤診斷、預防和治療提供潛在靶點。因此，本文用5種不同軟件預測靶向抑制RCOR3基因表達的miRNA，取交集后，通過多組學高通量數據初步驗證miRNA對RCOR3表達的抑制作用，為調控RCOR3的表達提供潛在靶點。

1 資料與方法

1.1 預測靶向抑制RCOR3表達的miRNA 登錄StarBase V2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)[6]，選擇miRNA-Target intersections，得到分別由RNA22、miRanda、PicTar、TargetScan和PITA5種軟件預測靶向抑制RCOR3表達的miRNA，取交集。

1.2 高通量數據驗證乳腺癌組織中miRNA對RCOR3表達的抑制作用 登錄LinkedOmics網站(http://www.linkedomics.org/login.php)[7]，癌癥類型選擇“TCGA_BRCA”，檢索數據集選擇“HiSeq RNA”，輸入基因“RCOR3”，靶數據集選擇“miRNASeq”，統計方法選擇“Spearman Correlation Test”，提交，下載結果，驗證乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b及miRNA-19b-3p與靶分子RCOR3表達的相關性，以P<0.05為差異具有統計學意義。

1.3 泛癌癥分析驗證miRNA對RCOR3的抑制作用 登錄StarBase V2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/index.php)[6]，選擇“miRNA-target intersections”，miRNA中分別輸入“hsa-miRNA-128-3p”、“has-miRNA-27a” “miRNA-27b” 及 “miRNA-19b-3p”，Gene Symbol中輸入“RCOR3”，點擊查詢。彈出頁面中點擊最右側“CancerNum”下的鏈接，下載結果。

1.4 統計學分析 采用SPSS軟件進行統計學分析，采用Spearman秩相關檢驗進行相關性分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 靶向抑制RCOR3基因表達的miRNA預測結果 分別利用RNA22、miRanda、PicTar、TargetScan和PITA軟件預測靶向抑制RCOR3表達的miRNA，取交集后得到miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b、miRNA-19b-3p，見圖1。

圖1 靶向抑制RCOR3基因表達的miRNA預測結果

2.2 高通量數據驗證結果 通過LinkedOmics驗證miRNA與靶分子RCOR3表達的相關性，結果顯示乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b、miRNA-19b-3p的表達均與靶分子RCOR3表達呈負相關(rs=-0.240，P<0.001；rs=-0.237，P<0.001；rs=-0.188，P<0.001；rs=-0.171，P=0.002)，見圖2。

圖2 乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b、miRNA-19b-3p表達與RCOR3表達的相關性

2.3 泛癌癥分析驗證結果 泛癌癥分析結果顯示，除乳腺癌之外，結直腸腺癌、肺腺癌、腎透明細胞癌和子宮內膜癌組織中miRNA-128-3p與RCOR3的表達均呈負相關(均P<0.05)，見表1；結直腸腺癌、膀胱尿路上皮癌、肺腺癌、肺鱗癌、腎透明細胞癌、子宮內膜癌和急性髓性白血病中miRNA-27a與RCOR3的表達均呈負相關(均P<0.05)，見表2。

表1 miRNA-128-3p與RCOR3表達相關性的泛癌癥分析

表2 miRNA-27a與RCOR3表達相關性的泛癌癥分析

3 討 論

miRNA是體內一類長度為21～25個核苷酸的內源性非編碼單鏈RNA，其主要通過完全或不完全互補結合至靶基因的3′非編碼區而調控靶基因的表達。鑒于miRNA抑制靶基因表達的機制較為明確，研究人員開發出多種計算方法和在線軟件用來預測靶向調節基因表達的miRNA。本課題組在前期研究中發現RCOR3基因是潛在的乳腺癌抑癌基因，因此，在本研究中我們利用多種在線軟件預測靶向調節RCOR3基因表達的miRNA，取交集后得到四種miRNA，即miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b、miRNA-19b-3p。miRNA-128 在多種疾病和正常組織中均不同程度的表達，具有廣泛的調節作用。在許多人類腫瘤中均能檢測到miRNA-128的異常表達，其參與癌癥相關的生物學過程，例如細胞增殖、分化和凋亡[8]。研究表明，miRNA-128-3p通過靶向調節E盒結合鋅指蛋白1而抑制食管鱗狀細胞癌轉移和上皮-間質轉化[9]；miRNA-128通過靶向調節環氧化酶-2抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲[10]，外周血循環miRNA-128還可作為膠質瘤的潛在診斷生物標志物[11]。另外，miRNA-128可以通過抑制c-Met/磷脂酰基醇3-激酶/蛋白激酶B途徑逆轉肺癌干細胞對吉非替尼的耐藥性[12]。以上研究結果均提示miRNA-128通過多種基因介導參與腫瘤的發生和發展。miRNA-27a分為miRNA-27a-3p和miRNA-27a-5p兩個亞型，有學者發現這兩種亞型在胃癌組織和細胞系中均高表達，但miRNA-27a-3p為主要亞型，其表達水平顯著高于miRNA-27a-5p，并可以促進胃癌細胞的增殖能力[13]。近年來研究表明，miRNA-27a-3p可抑制肝癌、鼻咽癌、骨肉瘤等多種腫瘤的發生發展，同時可作為三陰乳腺癌的潛在預后標志物[14-17]。

miRNA調節靶基因的機制明確，均為靶向抑制作用，據此本研究進一步通過miRNA組學和RNA-seq組學高通量數據分析，驗證了乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b及miRNA-19b-3p與靶基因RCOR3的表達均呈負相關(均P<0.05)，提示miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b及miRNA-19b-3p均可以靶向抑制RCOR3的表達。而且泛癌癥分析顯示多種癌癥中miRNA-128-3p和miRNA-27a均具有一定的保守性。

綜上所述，乳腺癌中miRNA-128-3p、miRNA-27a、miRNA-27b及miRNA-19b-3p與RCOR3表達均呈負相關，具有潛在的靶向抑制RCOR3表達的功能。