ASE-CAD結合柱后補償液相色譜法測定浙貝母中貝母素甲和貝母素乙

1.廣西中醫藥大學，廣西 南寧 530000；2.廣西-東盟食品藥品安全檢驗檢測中心，廣西 南寧 530000

浙貝母為百合科植物浙貝母FritillariathunbergiiMiq．的干燥鱗莖，具有清熱化痰止咳，解毒散結消癰的作用[1]。其有效成分主要為生物堿，其中又以貝母素甲和貝母素乙為主[2]。文獻顯示其含量測定主要是采用含有毒性大的三氯甲烷溶液提取，然后采用高效液相色譜-蒸發光散射檢測器法測定[1-3]，此類方法較成熟但前處理普遍耗時較長。前處理使用的ASE是一種在高溫高壓條件下萃取樣品中有機組分的新方法，其通過維持體系內的高壓狀態使得溶劑在高溫條件下不汽化，具有自動化，提取效率高等特點。電霧式檢測器(Charged Aerosol Detector，CAD)是在2004年才推出的一種較為新型的通用型檢測器，其響應值不依賴于被測物質的光學性質和離子化效率能檢測非揮發或很多半揮發性的物質。研究表明，與ELSD比較，CAD 具有更高的檢測靈敏度[4-5]和更加均勻一致的響應因子[6]，在中藥或天然藥物中的皂苷或膽酸等缺少紫外發色團的成分分析中應用較多[7-8]。柱后補償(反梯度)即在色譜柱后進入檢測器前加入另一分析溶劑，通過增加有機相比例，可以提高霧化效率，增加響應值，降低檢出限，提高檢測效果[9]。本研究采用快速溶劑萃取法提取浙貝母中貝母素甲和貝母素乙，并結合HPLC-CAD法進行分離測定。在實驗中采用梯度洗脫與柱后補償進行分析，進一步提高了貝母素甲和貝母素乙響應因子的一致性。本方法不僅操作簡便、準確度高，而且ASE法提取時間僅為常規方法的1/8，能滿足浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的快速測定。

1 儀器與材料

1.1 儀器 XA205DU電子分析天平、ASE350快速溶劑萃取儀(美國賽默飛世爾科技有限公司)、Ultimate3000雙三元高速液相色譜儀(含CAD檢測器，美國賽默飛世爾科技有限公司)。

1.2 材料 對照品貝母素甲(批號：110750-201311，含量按97.3%計)、貝母素乙(批號：110751-201611,含量按96.4%計)均購自中國生物制品檢定研究院；實驗用藥品均購自當地藥房(浙貝母產地浙江，批號：1510111、150827、150618；產地江西，批號151102)；水為純化水，甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備 精密稱定貝母素甲對照品，加甲醇制成每1 mL含貝母素甲1.4710 mg；精密稱定貝母素乙對照品，加甲醇制成每1 mL含貝母素乙1.4225 mg，作為對照品貯備液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末(過四號篩)約1 g，精密稱定，與適量硅藻土混合均勻填充于10 mL萃取池，按快速溶劑萃取儀優化的條件進行提取，萃取溶劑為75%乙醇、萃取溫度80 ℃、靜態萃取時間3 min、循環萃取2次、沖洗體積60%、吹掃時間100 s，萃取結束后，將萃取液置蒸發皿中蒸至近干，殘渣加甲醇使溶解并轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.2 ASE萃取條件的優化 利用單因素依次考察了萃取溫度(80 ℃、90 ℃、100 ℃)，靜態萃取時間(3、5、10 min)、循環次數(1次、2次、3次)。結果如圖2所示，結果表明結果不同的溫度和不同的萃取時間下貝母素甲和貝母素乙的總量沒有明顯差異；循環次數升到2次以后，總量即沒有明顯增加。最終確定最佳提取工藝組合為提取溫度80 ℃，提取時間3 min，提取次數2次，沖洗體積60 %，吹掃時間100 s。

2.3 色譜條件 色譜柱：ACE Excel C18-AR(2.1×50 mm，1.7 μm)；分析泵(右泵)流動相：乙腈-0.1%氨水，梯度洗脫：0 ～1 min，40%～40%乙腈，1～5 min，40%～60%乙腈，平衡時間為4 min；柱溫：40 ℃；流速0.3 mL/min；電噴霧檢測器(CAD)檢測，CAD霧化器溫度為45 ℃；進樣量5 μL。補償泵(左泵)流動相：乙腈-水，啟用Chromeleon 7工作站中的“反梯度”功能，設定延遲時間為0.5 min，流速0.3 mL/min，補償泵流動相與分析泵流動相在色譜柱后三通相接，混合后進入電霧式檢測器進行定量分析，霧化器溫度50 ℃，柱溫箱溫度35 ℃，進樣量3μL，理論塔板數按貝母素甲計不低于4000，結果見圖1。

2.4 線性關系考察 分別精密移取“2.1”項下貝母素甲對照品溶液(1.4710 mg/mL)、貝母素乙對照品溶液(1.4225 mg/mL)各0.2、0.5、1、2、4 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，制成標準工作曲線溶液。按照2.1項下色譜條件檢測，以質量濃度(X)對峰面積(Y)進行線性回歸。求得貝母素甲回歸方程：Y= 23.3914X+0.5806，r= 0.9992，在0.0294～0.5884 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。求得貝母素乙回歸方程：Y= 23.5288X+0.5429，r= 0.9991，在0.0284～0.5690 mg/mL范圍內呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗 精密吸取“2.1.1”項下對照品溶液，連續進樣6次，記錄峰面積，結果貝母素甲和貝母素乙峰面積RSD分別為0.5%、0.4%，表明儀器精密度良好。

2.6 重復性試驗 取同一批號樣品(批號：150827)各6份，每份 1 g，按“2. 1. 2”項下方法制備供試品溶液，按“2. 3”項下色譜條件平行試驗，結果貝母素甲和貝母素乙的平均含量分別為0.673 mg/g和0.453 mg/g，RSD分別為2.5%和2.1%。

2.7 穩定性試驗 取同一供試品溶液，室溫下放置，分別于0、2、4、8、16 h依法測定。結果貝母素甲和貝母素乙對照峰面積的RSD為1.5%、1.6%，表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.8 加樣回收率試驗 稱取已測定的同批號樣品(批號為150827)9 份，每份約0.5 g，精密稱定，分別精密加入貝母素甲與貝母素乙貯備液0.1、0.2、0.3 mL，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件測定，結果貝母素甲三個水平的平均回收率在97.23%～100.90%之間，RSD為1.89%；貝母素乙三個水平的平均回收率在96.32%～98.75%之間，RSD為1.39%。

2.9 樣品的測定 取各批次樣品，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項色譜條件下進行測定，記錄峰面積，計算含量，結果見表1，結果表明，藥典方法與ASE方法結果RAD在0.8%～3.4%之間，兩個方法間差異不大，但ASE方法實驗過程耗時僅20 min，在效率上有很大優勢。

表1 方法含量對比

3 討論

實驗采用快速溶劑萃取法提取浙貝母中貝母素甲和貝母素乙與藥典方法對比，其前處理時間僅為藥典的1/8，在效率上有較大的提升，另外在實驗操作上釋放了人力，降低了人為因素對實驗結果的影響。同時，在實驗中采用柱后補償技術進行有機相補償，提高了重現性及響應因子的一致性，可用于在缺少對照品的情況下，作為貝母素甲和貝母素乙的相對測定。

實驗建立了快速溶劑萃取-柱后補償液相色譜結合電霧式檢測器分析浙貝母中貝母素甲和貝母素乙的含量測定方法。經過線性、穩定性、重復性、精密度和加樣回收等方法學考察，結果表明本方法準確度高，精密度、重復性較好，可作為浙貝母中母素甲和貝母素乙的含量測定方法。