類風濕關節(jié)炎中醫(yī)證型與IL-17及其相關炎癥因子表達的研究

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1.貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院，貴州 貴陽 550003； 2.貴陽中醫(yī)學院，貴州 貴陽 550025

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以侵犯關節(jié)及關節(jié)周圍軟組織為主要特征的全身性自身免疫病。RA在全球的患病率為0.5%～1.0%，是臨床常見的難治性疾病，嚴重影響著患者的生活質量[1-2]。目前RA發(fā)病機制仍不清楚，近來研究發(fā)現(xiàn)RA的發(fā)病與體內白介素17(interleukin 17，IL-17)的表達有關[3-4]。IL-17是近年來新發(fā)現(xiàn)的一個白介素家族成員，其參與了RA的發(fā)病及病情進展，主要由Th17細胞分泌而產生，具有強大的致炎作用，在RA的發(fā)病及病情進展過程中發(fā)揮重要作用，成為近年來研究的一個熱點[5-7]。IL-17具有很強的促炎作用，能誘導IL-6、IL-22、IL-23等炎癥因子的產生，加強炎癥的表達，而這些炎癥因子反過來又能進一步促進Th17的活化[8]。Th1細胞主要產生干擾素γ(interferon γ，IFN-γ)等細胞因子，可以抑制Th17細胞，從而起到抗炎的作用；但IFN-γ的促炎效應及抑炎效應均有報道，故其屬于促炎因子還是抗炎因子仍存在一定的爭議[9]。調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg)主要產生IL-4、轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)等抗炎因子，在調節(jié)免疫紊亂，維持免疫耐受等方面發(fā)揮作用[10-11]。

RA屬中醫(yī)“痹證”、“歷節(jié)”、“尪痹”、“白虎病”等范疇。有研究發(fā)現(xiàn)不同中醫(yī)證型的RA患者，其在年齡、病程、地域、實驗室檢驗及檢查等方面存在差異[12-13]，但RA患者IL-17及其相關炎癥因子與中醫(yī)證型之間關系的研究卻寥寥無幾。因此，本研究通過檢測RA不同中醫(yī)證型患者血清中IL-17及其相關炎癥因子表達水平，探討IL-17及其相關炎癥因子與RA中醫(yī)證型之間的內在聯(lián)系，以期為RA的臨床辨證分型及治療提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 健康對照組來源于貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院體檢中心,已排除高血壓、糖尿病等長期慢性疾病，且實驗室檢測各項指標均在正常范圍的健康志愿者外周血標本30例，其中男性11例、女性19例，年齡18～60歲，平均年齡(46.25±14.55)歲。選取2017年6月至12月在貴陽中醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院風濕免疫科住院RA患者120例，其中男性9例、女性111例，年齡21～70歲，平均年齡(52.32±10.17)歲，病程1個月至26年，平均病程(59.73±11.28)月。

1.2 診斷標準 120例RA患者均符合2010年ACR/EULAR中對RA的診斷標準[14]，并根據(jù)《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》[15]將RA患者分為濕熱痹阻、寒濕痹阻、痰瘀痹阻、肝腎虧虛4個證型各30例。

1.3 納入標準 符合RA西醫(yī)診斷標準和中醫(yī)診斷標準；年齡在18～70歲的患者；未伴有其它影響治療和檢測指標的疾病；近3個月未應用非甾體抗炎藥、慢作用抗風濕藥、糖皮質激素及免疫抑制劑治療；愿接受檢測治療者，并簽訂知情同意書。

1.4 排除標準 不符合納入標準者；嚴重心腦肝腎功能不全及伴隨其它惡性腫瘤者；患者不能合作者。

1.5 實驗試劑 PharmingenTMFITC Mouse Anti-Human CD3(美國BD公司，批號：5320730)；PharmingenTMPerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD8(美國BD公司，批號：7096834)；PharmingenTMLeukocyte Activation Cocktail，with BD GolgiPlugTM(美國BD公司，批號：7030717)；PharmingenTMAlexa Fluor? 647 Mouse anti-Human IL-17A(美國BD公司，批號：7132681)；Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO(美國BD公司，批號：6292704)；人白介素4(IL-4)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號：N26015213)；人白介素6(IL-6)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號：N26011217)；人白介素17(IL-17)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號：N26015431)；人白介素22(IL-22)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號：N27147789)；人白介素23(IL-23)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號：N28015215)；人干擾素γ(IFN-γ)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號：N26011127)；人轉化生長因子β(TGF-β)酶聯(lián)免疫ELISA試劑盒96T(武漢華美生物科技有限公司，批號：N24015112)。

1.6 實驗儀器 臺式低速離心機(長沙平凡儀器儀表有限公司，TDL8M)；BD FACSCantoTM II型流式細胞儀(美國BD公司，V33947300248)；電熱恒溫水浴箱[北京醫(yī)療設備廠，(S)HHW21]；無菌流式管(貴州泰思騰生物科技有限公司，922746)；CO2培養(yǎng)箱(上海華連醫(yī)療器械公司，DH25000)；酶標分析儀(深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司，YZB/粵0198-2012)；洗板機(深圳市凱特生物醫(yī)療電子科技有限公司，KWP-100A)。

1.7 外周血淋巴細胞(PBMC)中IL-17表達檢測 采用流式細胞術檢測。取2 mL新鮮抗凝血與PBS液2 mL混勻，加入4 mL人淋巴分離液中，2000 r離心20 min，吸取乳白色單核細胞層即為PBMC，加入1 mLPBS液洗滌1次，配置250 μLPBMC；加入250 μL RPMI 1640細胞培養(yǎng)液，加入250xBD PharmingenTMLeukocyte Activation Cocktail, with BD GolgiPlugTM(刺激阻斷劑)2 μL，震蕩混勻，放入37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱4～6 h；加入20 μL BD PharmingenTMFITC Mouse Anti-Human CD3及5 μL BD PharmingenTMPerCP-CyTM5.5 Mouse Anti-Human CD8，混勻，室溫避光30 min；加入Fixation/Permeabilization Solution Kit RUO(破膜劑)1 mL，室溫避光30 min；加入PBS液1 mL，1500 r離心5 min，棄上清；加入PBS液1 mL，將細胞懸液分為兩份，分別加入20 μL BD PharmingenTMAlexa Fluor? 647 Mouse anti-Human IL-17A及Alexa Fluor? 647 Mouse IgG1 K Isotype control，4℃避光孵育30 min；再加入1 mL流式染色緩沖液洗滌1次，1500 r離心5 min，棄上清；加入PBS液500 μL重懸后上機檢測，用流式細胞儀分析外周血CD3+CD8-IL-17+表達的百分率。

1.8 血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的水平檢測 采用ELISA法檢測。RA患者及健康對照組清晨空腹抽取外周靜脈血，離心后取血清，按照ELISA試劑盒說明書上的步驟檢測血清IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的濃度。

2 結果

2.1 中醫(yī)證型與性別、年齡、病程的關系 結果顯示：不同中醫(yī)證型間在性別、年齡及病程上相比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 中醫(yī)證型與性別、年齡、病程的關系

2.2 流式細胞儀檢測各組間CD3+CD8-IL-17+表達水平比較 與健康對照組比較，RA患者各組CD3+CD8-IL-17+表達水平均明顯升高。各組間相互比較均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)。IL-17細胞的表達率由高到低依次為濕熱痹阻組、寒濕痹阻組、痰瘀痹阻組、肝腎虧虛組、健康對照組，見圖1～8、表2。

中醫(yī)證型例數(shù)CD3+CD8-IL-17+/%健康對照組300.12±0.03寒濕痹阻組305.53±0.78?濕熱痹阻組308.78±1.14?●肝腎虧虛組301.57±0.44?●■痰瘀痹阻組302.79±0.67?●■▲

注：與健康對照組相比，*P<0.05；與寒濕痹阻組相比，●P<0.05；與濕熱痹阻組相比，■P<0.05；與肝腎虧虛組相比，▲P<0.05。

2.3 ELISA法檢測各組間IL-4、TGF-β1的表達情況 與健康對照組相比，RA患者各組IL-4、TGF-β1表達水平均明顯下降(P<0.05)；肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組IL-4、TGF-β1水平明顯高于寒濕痹阻組、濕熱痹阻組，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；寒濕痹阻組、濕熱痹阻組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組比較亦無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；IL-4、TGF-β1檢測結果由高到低排列為健康對照組>肝腎虧虛組>痰瘀痹阻組>寒濕痹阻組>濕熱痹阻組。見表3。

表3 不同證型組間IL-4、TGF-β1的表達水平比較

注：與健康對照組相比，aP<0.05；與寒濕痹阻組相比，bP<0.05；與濕熱痹阻組相比，cP<0.05。

2.4 ELISA法檢測各組間IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的表達情況 與健康對照組相比，寒濕痹阻組、濕熱痹阻組、肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ水平均有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；濕熱痹阻組、寒濕痹阻組IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ水平明顯高于肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組，有顯著性差異(P<0.05)；濕熱痹阻組、寒濕痹阻組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組比較亦無統(tǒng)計學差異(P>0.05)；IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ檢測結果由高到低排列為濕熱痹阻組>寒濕痹阻組>痰瘀痹阻組>肝腎虧虛組>健康對照組。見表4。

表4 不同證型與IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的關系

續(xù)表4

表4 不同證型與IL-6、IL-17、IL-22、IL-23及IFN-γ的關系

注：與健康對照組相比，dP<0.05；與肝腎虧虛組相比，eP<0.05；與痰瘀痹阻組相比，fP<0.05。

3 討論

西醫(yī)認為RA可由多種免疫細胞及其分泌的細胞因子共同參與引起慢性炎癥病變，其病理特征是慢性炎癥細胞浸潤，滑膜增厚、血管新生等，最終導致關節(jié)畸形，功能喪失[16]。RA屬中醫(yī)“痹證”、“歷節(jié)”、“尪痹”、“白虎病”、“骨痹”、“鶴膝風”等范疇，主要臨床表現(xiàn)以肢體關節(jié)、肌肉疼痛、腫脹、酸楚、麻木、重著、變形、僵直、畸形及活動受限等癥狀為特征[17]。臨床實踐證明中醫(yī)藥辨證治療RA療效顯著，但中醫(yī)辨證分型缺乏客觀依據(jù)，且各醫(yī)家見解不同，辨證思路亦有差別，所以遣方用藥及療效評價差異較大，RA的中醫(yī)辨證評判標準并未統(tǒng)一，影響到臨床的進一步推廣。基于以上認識，實現(xiàn)中醫(yī)現(xiàn)代化，尋找與RA辨證論治相對應且具有可重復性的客觀醫(yī)學指標具有重要意義，既要遵循中醫(yī)理論，又能適應現(xiàn)代醫(yī)學的發(fā)展規(guī)律，才能更好地為患者服務。

本次實驗中對120例RA患者的研究發(fā)現(xiàn)IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ均在RA各證型間存在顯著差異，且明顯高于正常對照組，其在血清中的濃度由高到低依次為：濕熱痹阻組、寒濕痹阻組、痰瘀痹阻組、肝腎虧虛組、健康對照組，4種證型中濕熱痹阻型RA患者IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ的表達水平升高最顯著，提示濕熱痹阻型RA患者可能更多處于病情活動期，其自身免疫處于活躍狀態(tài)；從中醫(yī)上講，可能因外感濕熱之邪蘊結于內，或嗜食肥甘厚膩，脾為濕困，郁而化熱，濕熱壅盛，正邪交爭劇烈有關。本研究還發(fā)現(xiàn)，濕熱痹阻型、寒濕痹阻型RA患者IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ表達水平明顯高于肝腎虧虛型與痰瘀痹阻型，后兩型雖有升高，但表達遠不如前兩者顯著。RA患者血清中可出現(xiàn)IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ表達升高，與國內外研究報道相吻合，說明其這些炎癥因子共同參與了類風濕關節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。本研究結果與大多數(shù)研究相同，RA患者IFN-γ水平較正常組明顯升高，表明IFN-γ可能在RA中作為促炎因子而發(fā)揮作用。

IL-4、TGF-β1在RA各證型間存在統(tǒng)計學差異，且明顯高于正常對照組，其在血清中的濃度由高到低排列依次為肝腎虧虛組、痰瘀痹阻組、寒濕痹阻組、濕熱痹阻組；說明這兩個細胞因子共同抑制了RA炎癥的進一步發(fā)展。在國內外研究中發(fā)現(xiàn)：IL-4到底是抑制炎癥的表達還是促進炎癥的表達仍存在爭議[18-20]，本研究結果與大多數(shù)研究結果相一致：IL-4抑制了RA炎癥的表達，但限于本次實驗中樣本數(shù)量有限，未來有待大樣本實驗進一步進行論證。本次研究結果顯示：無論是活動期RA患者還是非活動期RA患者，其血清中TGF-β1的表達水平均顯著低于正常對照組，且活動期RA患者比非活動期RA患者血清中TGF-β1的表達量要更低，這與Valle等[21]的研究結果相一致。這說明TGF-β1在RA的病程中主要發(fā)揮免疫抑制作用，其表達量水平下降可引起RA患者調節(jié)免疫的活性下降。

本研究以炎癥細胞因子為切入點，通過ELISA和流式細胞術檢測不同中醫(yī)證型RA患者血清中IL-4、IL-6、IL-17、IL-22、IL-23、IFN-γ、TGF-β1的表達水平及IL-17在淋巴細胞中所占的比例，探討IL-17及相關炎癥因子與RA中醫(yī)證型之間的關系，未來可將更多的炎癥因子參與到RA不同中醫(yī)證型的研究中來，更好地為中醫(yī)辨證分型及治療提供依據(jù)和借鑒。