大葉白麻總黃酮中白麻苷的藥代動力學研究

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1.新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所，新疆 烏魯木齊 830002； 2.新疆大學生命科學與技術學院，新疆 烏魯木齊 830046

白麻屬大葉白麻(PoacynumhendersoniiWoodson)喜生于鹽堿荒地、沙漠及戈壁荒灘等干旱地區，主要分布在新疆、青海、內蒙、甘肅等地區，其中新疆羅布泊、塔里木河、孔雀河畔及阿克蘇地區有豐富的大葉白麻野生資源[1-2]。《維吾爾藥志》記載大葉白麻清熱涼血、利尿消腫、行氣涼肝、鎮靜安神，用于頭暈、心悸、神經衰弱、高血壓及肝硬化引起的腹水[3]。有學者認為，大葉白麻和羅布麻藥理活性相似，金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷等黃酮類成分是二者的主要活性成分。然而，近年研究表明，二者在化學組成上有較大差異[4-9]，比如羅布麻中金絲桃苷、異槲皮苷、紫云英苷的含量均高于大葉白麻，并且二者特征成分不同，大葉白麻含白麻苷、蘆丁、biapigenin和加貫葉金絲桃素，羅布麻則含querciturone、乙酰金絲桃苷、穗花衫雙黃酮等成分[8-10]。大葉白麻總黃酮由大葉白麻經乙醇提取、大孔樹脂柱純化制得，其抗炎活性優于羅布麻總黃酮[11]，白麻苷作為其主要成分含量達11.98%，另有研究報道白麻苷具有抗氧化、腦缺血保護等作用[12-13]。因此，本實驗以白麻苷為考察指標，研究大葉白麻總黃酮在大鼠體內的藥代動力學特征，以期為大葉白麻的開發利用提供依據。

1 儀器與材料

1.1 儀器 U3000高效液相色譜儀(Thermo)，MIKRO 220R冷凍離心機(Hettich)，XH-C渦旋混合器(江蘇金怡儀器科技有限公司)，DT2012電子天平(余姚市金諾天平儀器有限公司)，AB265-S分析天平(梅特勒-托利多公司)，JY92-2D超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 白麻苷(批號：P09J6R1，上海源葉生物科技有限公司)，大葉白麻(新疆)，甲醇、乙腈為色譜純(Sigma)，超純水(自制)。

1.3 動物 SPF級SD大鼠10只，雄性，體重為(200±20)g，新疆維吾爾自治區實驗動物研究中心，生產許可證號：SCXK(新)2016-0001。

2 方法

2.1 大葉白麻總黃酮制備 大葉白麻用20倍60%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，合并2次提取液，濃縮至無醇，過大孔樹脂柱，水洗除雜后，以3BV 60%乙醇溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮、干燥，HPLC檢測黃酮含量[14]。

2.2 大鼠血漿中白麻苷的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱：XTARRA RP18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；乙腈：0.2%磷酸水溶液梯度洗脫(0～10 min，15%∶85%；10～50 min，18%∶82%；50～65 min，18%∶82%)；柱溫：35℃；流速：1 mL/min；檢測波長：360 nm；進樣量：100 uL。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取白麻苷對照品適量，于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，制成濃度為97.0200 mg/L的儲備液。分別精密吸取儲備液適量，用50%甲醇稀釋，制成濃度為97.0200、48.5100、24.2550、19.4040、9.7020、4.8510、2.4255、1.2128、0.6064、0.3032 mg/L的系列對照品溶液，4℃保存，備用。

2.2.3 血漿樣品預處理 精密吸取大鼠血漿100 μl，加入200 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋2 min，13000r/ min離心10 min，取上清過0.22 μm的微孔濾膜，即得。

2.2.4 專屬性 將空白血漿、白麻苷添加血漿、灌胃大葉白麻純化物后血漿，按“2.2.3”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，考察方法專屬性。

2.2.5 線性關系考察 精密吸取100 μL大鼠空白血漿10份，于1.5 mL的離心管中，分別加入25 μL系列標準溶液，配制成白麻苷濃度為19.4040、9.7020、4.8510、3.8808、1.9404、0.9702、0.4851、0.2426、0.1213、0.0606 mg/L的血漿樣品，按“2.2.3”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，以峰面積為縱坐標，血藥濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.2.6 精密度實驗制備 白麻苷濃度分別為0.4851、3.8808、19.4040 mg/L的血漿樣品(n=5)，按“2.2.3”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，連續3 d，分別計算日內RSD和日間RSD。

2.2.7 準確度實驗制備 白麻苷濃度分別為0.4851、3.8808、19.4040 mg/L的血漿樣品(n=5)，按“2.2.3”項下方法處理，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，以標準曲線計算濃度和相對回收率。

相對回收率=測定量/實際添加量

2.2.8 基質效應和提取回收率實驗 制備白麻苷濃度分別為0.4851、3.8808、19.404 mg/L的血漿樣品(n=5)，按“2.2.3”項下方法處理，按“2.1.1”項下色譜條件進樣，峰面積為SET3。取空白血漿，按“2.2.3”項下方法處理，取上清液后加入對照品溶液，使其濃度與SET3一致(n=5)，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，峰面積作為SET2。將對照品溶液用50%甲醇溶液稀釋，使其濃度與SET3一致，按“2.2.1”項下色譜條件進樣，重復5次，峰面積作為SET1。

基質效應=SET2/SET1提取回收率=SET3/SET2

2.2.9 穩定性實驗 制備白麻苷濃度分別為0.4851、3.8808、19.4040 mg/L的血漿樣品(n=3)，室溫下放置24 h后測定，考察短時穩定性。于-20℃冰凍30 d后取出后測定，考察長期穩定性。

2.3 藥代動力學實驗 雄性SD大鼠10只，灌胃給藥前禁食不禁水。4只大鼠作為空白，6只大鼠灌胃大葉白麻總黃酮(1.05 g/kg，按白麻苷折算給藥劑量為125.79 mg/kg)，灌胃體積10 mL/kg，于給藥前后0、5、10、20、30、45 min、1、2、3、4、6、8、12 h眼眶后靜脈叢取血0.5 mL，置于1.5 mL已肝素化的離心管中，13000r/ min離心10 min，分離得到血漿，-20℃保存。

2.4 數據處理 數據均用Excel處理，表示為(x±s)，藥動學參數采用 PK solution 2.0TM(Summit Research Services，USA)藥代動力學軟件分析。

3 結果

3.1 大葉白麻總黃酮含量測定 HPLC檢測，大葉白麻總黃酮中白麻苷、異槲皮苷、紫云英苷、蘆丁和金絲桃苷的含量分別為11.98%、7.44%、0.67%、0.30%和0.14%。如圖1所示。

3.2 大鼠血漿中白麻苷的含量測定

3.2.1 專屬性 白麻苷的保留時間為19.793 min，分離度>9，理論塔板數>10000，拖尾因子均符合測定要求，空白血漿中內源性物質不干擾白麻苷的含量測定。如圖2所示。

3.2.2 線性關系考察 白麻苷在0.0606～19.4040 mg/L的范圍內線性關系良好，回歸方程為Y=0.1290869X-0.0310899(R=0.9996)。如圖3所示。

3.2.3 精密度實驗 低、中、高3個濃度的血漿樣品，日內RSD分別為1.53%、1.07%和3.62%，日間RSD分別為8.33%、3.56%和4.03%，方法精密度良好。

3.2.4 準確度實驗 低、中、高3個濃度的血漿樣品，平均相對回收率分別為102.29%、92.95%和90.11%。見表1。

表1 準確度實驗結果

3.2.5 基質效應和回收率實驗 白麻苷檢測基本不受基質干擾，平均提取回收率為97.91%，符合生物樣品檢測要求。見表2、表3。

表2 大鼠血漿中白麻苷的基質效應

表3 大鼠血漿中白麻苷的提取回收率

3.2.6 穩定性實驗 ”低、中、高3個濃度的血漿樣品，室溫下放置24 h后測定RSD分別為4.10%、4.08%和4.26%，-20℃冰凍30 d后測定RSD分別為3.93%、3.56%和3.69%，血漿樣品短時、長期穩定性良好。

3.3 藥代動力學實驗 6只大鼠以1.05 g/kg劑量的大葉白麻總黃酮灌胃給藥，3 h后檢測不到白麻苷，血藥濃度-時間曲線如圖4所示。 白麻苷在大鼠體內的代謝過程符合開放的二室模型：吸收速率常數Ka=0.47 min，表明白麻苷在胃腸道能很快的被吸收；灌胃后血漿中白麻苷在15 min即達峰值CMAX=0.53mg/L，且分布速率常數Kd=0.03 min，表明白麻苷進入大鼠體循環后，分布迅速；消除速率常數Ke=0.00 1 min，消除半衰期t=474.13 min，表明白麻苷在體循環中消除的很慢。見表4。

表4 大鼠灌胃給藥后白麻苷的平均藥代動力學參數

參數單位數值AUC(0-t)mg·min·L-163.10± 6.22AUC(0-∞)mg·min·L-1253.10±60.92MRTmin670.42± 206.80T1/2amin18.34± 9.63T1/2dmin32.85± 27.06T1/2emin474.13±143.64Tmaxmin15.00±7.75Cmaxmg·L-10.53±0.10Kamin-10.47±0.02Kdmin-10.03±0.02Kemin-10.001±0.001CLL·min-1·kg-14547.08±908.87VdmL·kg-12957954.15±238713.30AUMC(0-∞)mg·min·L-1179748.40±100513.70

4 結論

本實驗建立了大鼠血漿中白麻苷的HPLC含量測定方法，方法專屬性良好、簡便易行，相對回收率、精密度、穩定性等均符合生物樣品的分析要求。以1.05 g/kg劑量的大葉白麻總黃酮提取物灌胃大鼠，其主要成分——白麻苷在體內代謝過程符合開放二室模型，在體內能迅速分布發揮藥效，同時持續時間較長。大葉白麻總黃酮的主要成分是白麻苷，并含有異槲皮苷、紫云英苷、蘆丁及金絲桃苷。文獻報道，大鼠灌胃羅布麻提取物后，血漿中可檢測到金絲桃苷和異槲皮苷[15-16]。筆者在實驗中嘗試檢測大鼠血漿中的金絲桃苷、異槲皮苷、蘆丁、紫云英苷，但均未檢測到化合物原型，而是出現了其他色譜峰，但是鑒于檢測手段的局限性，無法確認代謝產物，這與文獻報道有一定差異。一方面可能是由于這些黃酮成分代謝很快，在大鼠體內快速轉化為其他成分，另一方面也可能與樣品處理及方法檢出限有關。