IFN-γ基因敲除小鼠的繁育及其對TgCatCHn4弓形蟲的感染研究

, , ,

γ干擾素(Interferon gamma，IFN-γ)，又名Ⅱ型干擾素或免疫干擾素，主要由單核巨噬細胞、T細胞和NK細胞產生[1]。IFN-γ的主要生物學作用是促進免疫、抗病毒和抗腫瘤[2]等，同時還具有抗寄生蟲作用[3]。弓形蟲作為食源性寄生原蟲，會導致人和動物的流產，畸胎或死胎，對人和動物的健康造成威脅[4-5]。弓形蟲基因型豐富多樣，表現出不同的遺傳多樣性和致病性，我國主要流行Chinese1(ToxoDB#9)型弓形蟲，不同分離株毒力差異較大，部分Chinese1型弓形蟲蟲株感染小鼠后呈慢性經過[6-9]。目前基因敲除小鼠用于感染性疾病及其免疫應答的研究較多，但還未見關于IFN-γ-/-小鼠對我國弓形蟲蟲株的感染情況研究。為獲得弓形蟲弱毒株的急性動物模型，從美國Jackson實驗室購入IFN-γ-/-小鼠冷凍胚胎，經復蘇培養及6個月的飼養和繁育，最終成功獲得了大量IFN-γ-/-小鼠，并對比研究了IFN-γ-/-小鼠和BALB/c小鼠對TgCatCHn4(Chinese1)弓形蟲蟲株的感染率及宿主存活情況。

1 材料與方法

1.1試驗材料 TgCatCHn4分離于貓組織[9]，由河南農業大學獸醫病理實驗室保存。

1.2試驗動物 IFN-γ-/-小鼠胚胎購于美國Jackson實驗室(Stock No：002287)，經北京協和醫院醫學實驗動物研究所復蘇，獲得6只小鼠，其中雄性3只(純合子1只，雜合子2只)，雌性3只(純合子1只，雜合子2只)。另從鄭州大學試驗動物中心購入BALB/c小鼠40只。

1.3IFN-γ-/-小鼠的飼養、繁育及鑒定 小鼠置于實驗室SPF環境中，按照相應飼養標準進行飼養。飼養過程中，每日添加飲水、補充飼料，適時更換墊料。小鼠繁殖時，IFN-γ+/-小鼠以雌雄按3∶1比例合籠飼養。哺乳期滿的仔鼠與母鼠分開，雌雄分籠飼養，并打耳標、記錄數量。

剪取仔鼠(3周齡)尾尖組織0.5 cm，按照組織DNA提取試劑盒(天根生化科技有限生物，批號：DP304)說明提取尾尖DNA。IFN-γ擴增引物1：5′-CCT TCT ATC GCC TTC TTG ACG-3′，引物2：5′-AGA AGT AAG TGG AAG GGC CCA GAA G-3′，引物3：5′-AGG GAA ACT GGG AGA GGA GAA ATA T-3′。目的片段大小為500 bp的條帶為IFN-γ-/-小鼠，210 bp的條帶為IFN-γ+/+小鼠，兩條210 bp和500 bp的條帶為IFN-γ+/-小鼠。

1.4小鼠感染弓形蟲及弓形蟲負載量 從Vero細胞培養瓶中收集TgCatCHn4弓形蟲速殖子，IFN-γ-/-小鼠(n=5)和BALB/c小鼠(n=24)分別經背部皮下注射1 mL弓形蟲(104個/mL)。常規飼養，每日觀察臨床表現、死亡日期并記錄。接種后30 DPI(30 days post inoculation，30 DPI)的小鼠，對肺臟及腸系膜淋巴結進行涂片鏡檢，觀察是否含有弓形蟲速殖子。存活大于30 DPI的小鼠面靜脈采血，采用改良凝集試驗(Modified Agglutination Test，MAT)檢測血清中弓形蟲抗體，檢查其感染情況。存活大于30 DPI并自然死亡的小鼠，取腦組織壓片鏡檢觀察包囊并計數[10]。

將含有弓形蟲包囊的小鼠腦組織或含有速殖子的小鼠肺臟或淋巴結，接種于生長良好的Vero細胞培養瓶中，每周更換兩次細胞培養液，并在倒置顯微鏡下觀察速殖子。

1.5統計分析 采用軟件Graph Pad Prism 5.0 software (Graphpad Software Inc., San Diego, CA, USA) 對數據進行統計分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1小鼠繁殖結果及生長情況 經IFN-γ+/-小鼠雌性和雄性交配的方法繁育，成功獲得了子代小鼠。IFN-γ+/-小鼠毛發光亮順滑，四肢有力，尾長，行動靈活；IFN-γ-/-小鼠身形較為瘦小，行動靈活，善跳躍。平均每只IFN-γ+/-母鼠每胎生產10～12只幼鼠，經過6個月的繁育共生產小鼠799只，存活758只，存活率達94.9%。

M: DNA Marker 700；1-16:小鼠DNA擴增結果；1-3、7-11、15-16為野生型；4-5為純合子；6、13-14為雜合子。

2.2子代小鼠IFN-γ基因鑒定結果(圖1) 親代為IFN-γ+/-雜合子小鼠交配，子代小鼠有雜合子、野生型、純合子3種表現型。使用瓊脂糖凝膠電泳進行IFN-γ基因鑒定，引物1和引物3的擴增產物為500 bp大小的片段，引物2和引物3的擴增產物為一條210 bp大小的片段，結果如圖1所示。經基因鑒定，獲得IFN-γ+/+308只，IFN-γ+/-404只，IFN-γ-/-46只，各種基因所占比例為：IFN-γ+/+占40.6%；雜合子IFN-γ+/-占53.3%；純合子IFN-γ-/-占6.1%，野生型：雜合子：純合子的比例約為7∶9∶1。

2.3TgCatCHn4弓形蟲對IFN-γ-/-小鼠和BALB/c小鼠的致病性研究(表1) 由表1， IFN-γ-/-小鼠感染104個TgCatCHn4弓形蟲速殖子后，存活時間為17.0±1.0 DPI(16DPI～18DPI)，急性感染期死亡率為100%，死亡小鼠肺淤血，肺臟涂片可見大量弓形蟲速殖子。30 DPI，小鼠血清弓形蟲IgG抗體結果顯示，BALB/c小鼠的弓形蟲感染率為100%，臨床表現未見明顯異常，急性感染期死亡率為0%，BALB/c小鼠存活時間為304.0±43.7 DPI(51 DPI～726 DPI)，自然死亡小鼠只有10%的大腦研磨液中檢出弓形蟲包囊，包囊數量2.6±1.7個/只小鼠大腦。弓形蟲陽性小鼠組織接種Vero細胞后，IFN-γ-/-小鼠肺臟組織和BALB/c小鼠大腦組織內的TgCatCHn4弓形蟲在Vero細胞培養后，初次觀察到速殖子的時間分別為2 d和19 d。

表1 TgCatCHn4株弓形蟲對IFN-γ-/-小鼠和BALB/c小鼠的致病性Tab.1 Pathogenicity of TgCatCHn4 Toxoplasma gondii on IFN-γ-/- mice and BALB/c mice

3 討 論

研究表明，IFN-γ在抗弓形蟲感染中起重要作用。體外試驗發現，IFN-γ能夠抑制弓形蟲速殖子繁殖，并可抑制弓形蟲包囊活化[11]，調控免疫細胞限制弓形蟲在大腦的生長[12]。小鼠感染試驗也證實，IFN-γ具有抑制弓形蟲緩殖子轉變為速殖子的作用[13]。

全世界共鑒定了231種弓形蟲基因型，1 457株弓形蟲蟲株(http://ToxoDB.org)，我國弓形蟲蟲株分離較少，目前已從人和動物分離得到約122株弓形蟲蟲株[9]，89%的蟲株基因型為ToxoDB#9(Chinese1)，Chinese1不同分離蟲株間毒力差異較大，部分蟲株毒力較弱[6-9]，動物模型中常難以收獲蟲體。可使用貓進行弓形蟲卵囊的收獲，具有較高的收獲率，且耗時短(21 DPI)[9]。因此在弓形蟲的致病機制和疫苗研究中，獲得弓形蟲弱毒株的急性感染模型十分重要。

近年來，有大量試驗構建小鼠模型研究弓形蟲的致病機理。弓形蟲的易感性和致病性與小鼠品系有一定關系，降序排列依次為：IFN-γ基因敲除小鼠、人白細胞抗原(Human Leucocyte Antigen, HLA)A1101轉基因小鼠、HLA A0201轉基因小鼠、HLA B0702轉基因小鼠、Swiss Webster、C57/black、BALB/c[10]。本研究使用IFN-γ-/-小鼠進行弓形蟲感染試驗研究發現，感染TgCatCHn4弓形蟲蟲株后，IFN-γ-/-小鼠死亡率100%，均在急性期死亡，肺臟涂片可見大量速殖子陽性，與BALB/c小鼠比較，可在較短時間收獲弱毒弓形蟲蟲體，利于后續研究。本研究結果顯示IFN-γ-/-小鼠對弓形蟲的易感性強于BALB小鼠，這與報道結果一致。IFN-γ-/-小鼠和BALB/c小鼠分別感染100個Me49株弓形蟲卵囊，100% 的IFN-γ-/-小鼠(25/25)呈弓形蟲急性感染而死亡，存活期小于14 DPI，但BALB/c小鼠(23/1)的死亡率是4%，大腦平均包囊126個[10]。IFN-γ-/-小鼠和Swiss小鼠感染TgCatCHn1-2，TgCatCZg 1-4后，IFN-γ-/-小鼠均呈弓形蟲急性感染，存活期20-27 DPI，而Swiss小鼠未見明顯臨床癥狀，存活期超過42DPI[14]。可見，與BALB小鼠和Swiss小鼠比較，IFN-γ-/-小鼠對弓形蟲更易感。

對IFN-γ基因敲除小鼠進行繁育，可為飼養繁育該品系小鼠提供技術參考依據。IFN-γ基因敲除小鼠對弓形蟲的臨床表現，也說明IFN-γ在弓形蟲感染過程中具有重要的抗蟲免疫作用，為深入研究弓形蟲急性感染的免疫機制提供了理想模型。