下呼吸道感染病原體檢測方法研究進展

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下呼吸道感染(lower respiratory tract infection, LRTI)是常見感染性疾患[1],主要包括慢性支氣管炎、肺炎、支氣管擴張等。臨床上LRTI診斷以患者出現咳嗽、咳痰、痰液粘稠，肺部出現濕羅音并伴有發熱或白細胞總數和嗜中性粒細胞比例增高或X線顯示肺部有炎性浸潤性病變為依據；或以慢性氣道疾患患者穩定期繼發急性感染，并有病原學改變或X線胸片顯示與入院時比較有明顯改變或新病變為依據[2]。LRTI以抗生素治療為主，但治療前必須確定所引起下呼吸道感染的病原體，因此，LRTI病原體快速檢測十分重要。標本類型及標本質量是檢測的基礎和根本保障，高質量的標本在快速檢測中起到重要作用。病原體的檢測技術迅速發展在臨床LRTI的診斷和治療起著重要支撐。目前國內少有對呼吸道病原體檢測技術的綜述報導。本文將下呼吸道感染標本類型和病原體檢測方法進行綜述，旨在指導臨床根據疾病采集相應的樣本類型，選擇適宜的檢測方法，快速確定感染病原體并及時治療。

1 下呼吸道感染常規檢測標本種類

下呼吸道感染常見標本類型有痰液、肺泡灌洗液、纖支鏡防污染毛刷、外周血、漿膜腔積液。痰液是氣管、支氣管和肺泡所產分泌物，呼吸道病變時痰液分泌增多。收集的痰液必須是從肺部咳出且必須新鮮[3]。痰樣本采集易受呼吸道正常定植菌群的影響，一般可通過定量或半定量檢測或涂片檢測來評價其致病性，若白細胞吞噬作用和白細胞聚集部位相應細菌的存在或定量培養分離的細菌濃度≥106cfu/mL，一般可認為是致病因子[4]。痰液中病原體最主要的檢測方法是分離培養法和涂片鏡檢法。肺泡灌洗液可收集到肺部較大范圍病原體樣本，取樣時應保證一定的回收量，而且避免將血液和上皮細胞帶入樣本[5]。分離細菌濃度≥104cfu/mL時則可認為是此病原體引起的感染。肺泡灌洗液中病原體的檢測方法主要有分離培養、涂片鏡檢法、多重PCR等。防污染毛刷可深入肺炎病變部位定向采集樣本[6]，分離細菌濃度≥103cfu/mL時則可認為是此病原體引起的感染，常用的檢測方法包括分離培養、熒光定量PCR等。較嚴重患者的下呼吸道病原體會蔓延至外周血中，外周血樣本應避免劇烈震蕩，通常通過分離培養以及檢測病原體的IgM抗體來確定患者被哪種病原體所感染。常用的IgM檢測方法有酶聯免疫吸附法、免疫熒光法、膠體金免疫層析法、熒光免疫層析法、電化學發光免疫分析等。漿膜腔積液主要包括胸水、腹水、心包積液，是嚴重病癥的典型臨床表現。常用的檢測技術有分離培養、涂片鏡檢、熒光定量PCR法等。臨床上，痰液最易采集，因而是最主要的標本類型，但是痰液采集質量不易控制，易受正常定植菌群的影響。而肺泡灌洗液和纖支鏡防污染毛刷的樣本類型能避免上呼吸道正常菌群的影響，樣本質量更高，陽性率和合格率更高[7]。

2 下呼吸道感染常見及非常見病原體

下呼吸道感染病原體包括細菌、真菌、支原體、衣原體、病毒、寄生蟲等。常見細菌類病原體主要有流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、嗜肺軍團菌、百日咳桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉桿菌、腦膜炎奈瑟菌、溶血葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞桿菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、陰溝腸桿菌等[8-9]。真菌類主要有白色念珠菌、光滑念珠菌、熱帶念珠菌、克柔假絲酵母菌、隱球菌、組織胞漿菌、煙曲霉等[10-11]。病毒類主要有腺病毒、呼吸合胞病毒、流感病毒、副流感病毒、博卡病毒、人類冠狀病毒、偏肺病毒、鼻病毒、腸病毒等[12-13]。寄生蟲主要有毛滴蟲、肺吸蟲卵、蛔蟲蝴、鉤蟲蝴及卡氏肺囊蟲等。其他類還有肺炎支原體、肺炎衣原體、沙眼衣原體等[14]。不常見的下呼吸道感染病原體主要有：人類蒼白桿菌、鸚鵡熱衣原體、單增李斯特菌、頭孢霉菌、超鞭毛蟲、蠊纓滴蟲等等[15-19]。

3 病原體的檢測方法

3.1 基于病原學的檢測方法

3.1.1病原體分離培養法 病原體分離培養法是確定下呼吸道感染病原體的“金標準”，是臨床檢驗科進行呼吸道分泌物檢測的常規方法，也是目前我國在病原體感染狀況調查研究方面的重要檢測方法之一[20]。

3.1.2涂片鏡檢法 涂片鏡檢法是病原學診斷的經典方法，檢測最為迅速，但特異性較差，要求實驗人員有豐富的經驗。臨床上將分離培養法和涂片鏡檢法相結合，提高診斷正確性，降低假陰性、假陽性[21]。

3.2 基于分子生物學的檢測方法

3.2.1聚合酶鏈式反應 聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction，PCR)是體外快速擴增特定基因或DNA序列最常用的方法，也是其他分子生物學檢測方法的基礎。DNA模板經高溫變性后雙鏈打開，低溫復性時引物與模板結合，72 ℃下子鏈延伸，DNA聚合酶聚合游離的脫氧核苷酸。變性、復性、延伸三步多次循環擴增，富集目的基因。擴增反應結束后排除污染因素后結果為陽性，即確診該病原體的感染[22]。常規PCR檢測方法僅用于定性實驗，在定量研究中具有一定的局限性，但它快速、靈敏、特異性強的優點與其他技術的結合對病原體的檢測更為有效。

表1 下呼吸道感染檢測常用標本類型 Tab.1 Specimen types detection for lower respiratory tract infection

3.2.2基質輔助激光解吸電離源聯用飛行時間質譜 基質輔助激光解吸電離源(matrix-assisted laser desorption ionization, MALDI)與飛行時間質譜(time of flight mass spectrometry，TOF MS)聯用已經成為生命科學研究中非常重要的工具。用一定強度的激光照射樣品與基質形成的共結晶薄膜，基質從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質樣品之間發生電荷轉移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場的作用下加速飛過飛行管道，由于離子飛行距離一定,不同質荷比的離子通過飛行管到達檢測器的時間不同，從而達到檢測目的。Atqah AbdulWahab等用MALDI-TOF MS技術對123株下呼吸道分泌物分離菌進行了鑒定，結果顯示對于常見的下呼吸道病原體如流感嗜血桿菌、肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌等，都有很好的鑒定性，但其對罕見的革蘭氏陰性菌的鑒定可能存在一定限制[23]。Atalay A等也用此技術對下呼吸道樣本和其他樣本中的曲霉菌株進行了檢測，其中煙曲霉、黃曲霉黑曲霉和土曲霉的檢出率分別為50%、33.3%、12.5%和4.2%，與常規形態學檢測有良好的一致性[24]。

3.3 基于免疫學的檢測方法

3.3.1酶聯免疫吸附反應 酶聯免疫吸附反應(ELISA)采用抗原與抗體的特異反應將待測物與酶連接，通過酶與底物產生的顏色反應進行定性和定量檢測。現已有多種商業化酶聯免疫吸附反應試劑盒，可檢測包括流感病毒、肺炎衣原體、肺炎支原體等多種常見下呼吸道病原體[25]。此方法檢測快、可同時檢測大量樣本，對設備要求不高、操作簡便，但操作規范性強，每一步操作不謹慎都有可能造成各種檢測問題，假陽性較多[26]。近年來，酶聯免疫吸附分析雙抗夾心檢測法開始應用于下呼吸道感染病原體的檢測，其具有檢測時間短、特異性強、靈敏度高的特點[27]。

3.3.2凝集法 凝集法是臨床診斷、實驗室研究和細菌學鑒定的重要手段之一。用已知細菌抗血清檢測待檢細菌，或用已知病原菌檢測患者血清中的相應抗體。此法快速、簡便、不受環境和實驗條件的約束，在實驗室和臨床上廣泛使用。

3.3.3直接免疫熒光法 直接免疫熒光法是直接用熒光標記抗體來檢測特異性抗原的方法。此方法速度快、特異性強，但其敏感性不高，可能產生交叉反應而出現假陽性結果，在臨床診斷方面的應用有一定局限性[22,28]。

3.3.4間接免疫熒光法 間接免疫熒光法是將樣本中的特異性抗體與包被在固相上的抗原結合，已結合的抗體再與熒光標記的抗體結合，在熒光顯微鏡下即可觀察結果。現已有多種商業化間接免疫熒光法檢測多種下呼吸道感染病原體試劑盒，為病原體的檢測和診斷提供了很大方便。西班牙VIRCELL公司生產的呼吸道聯合檢測試劑盒可檢測包括嗜肺軍團菌、肺炎衣原體等9種常見呼吸道病原體。莫偉平等利用此技術對13240例呼吸道感染患者血清進行檢測和分析，結果顯示呼吸道感染的病原體主要為肺炎衣原體和病毒，也證實了采用間接免疫熒光法檢測呼吸道病原體的IgM 抗體可作為臨床的診斷和治療的重要依據[29]。

4 多病原體同時檢測方法

傳統方法每次僅能檢測一種病原體，但大多數下呼吸道感染患者為多種病原微生物共同感染，這些病原體所引起的病癥相近，僅靠常規檢測難以鑒別診斷。檢測多種病原微生物的技術和方法的建立不僅可以成功解決上述難題，在實驗室和臨床樣本的篩選與分離的過程中也起著十分重要的作用。

4.1多重PCR 多重PCR是在一次PCR反應中實現對多種DNA模板檢測和定量的方法。這種方法把多種病原體檢測集中到一個封閉體系中反應，多反應同時進行，根據不同引物和探針對各種病原體進行定性和定量，既節約了成本又節省了時間，而且靈敏度高，大大提高病原體的檢出率。實際應用中以逆轉錄PCR和熒光定量PCR最廣泛。多重逆轉錄PCR常用于同時檢測多種流感病毒等RNA病毒，此法具有較好的特異性和敏感性。Zhao MC等使用商業化試劑盒同時檢測572份呼吸道樣本中的11種常見呼吸道病毒、以及肺炎支原體和肺炎衣原體，87.5%的樣本中至少有一種病原體的檢出，具有高靈敏度和特異性[30]。多重熒光定量PCR的應用幾乎涵蓋了所有下呼吸道病原微生物的檢測，N. J. Gadsby等建立了利用多重熒光定量PCR同時檢測并準確定量包括肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等在內的8種常見下呼吸道病原微生物的方法，對249株陽性對照樣本的準確定量證實了此方法的有效檢測[31]。

4.2多重PCR聯用毛細管凝膠電泳 毛細管凝膠電泳具有電泳和色譜的功能，能夠高效分離病原體，與多重PCR的聯用使得檢測效率更快、靈敏度和特異性更高。Stevenson JB等用此技術建立同時檢測流感病毒A、流感病毒B和呼吸合胞病毒的方法，對30個陽性樣本的檢出率達93%，另外兩個樣本因樣本量過少而未能檢出，此方法的建立和有效檢測豐富了多病原體同時檢測的方法[32]。巢式多重PCR是在普通多重PCR的基礎上再進行一次或兩次PCR反應，前一次的擴增反應中出現非特異性片段，則下一次的擴增中引物將不能與此片段進行匹配結合，因此它比多重PCR有更好的敏感性和特異性。蔣璐晰等利用巢式多重PCR聯用毛細管凝膠電泳技術建立了同時檢測13種下呼吸道病原微生物的方法，對152個臨床樣本的檢測表現出100%的敏感性，在呼吸道病原體分子流行病學調查中具有很大潛力[33]。

4.3DNA微陣列 DNA微陣列就是將樣品DNA進行PCR擴增和標記，再與含有大量不同DNA分子的DNA芯片進行雜交反應，通過檢測相應位置雜交探針，實現基因信息的快速檢測，具有微型化、快速、準確、靈敏度高，以及在同一芯片上同時大信息量平行檢測的優勢。Gemma A. Cannon等用此技術建立了同時檢測16種病毒和兩種非典型細菌的呼吸道病原體的方法，其在急性呼吸道病原體鑒定上對多重逆轉錄PCR檢測具有一定替代性[34]。Keyvani H等應用DNA陣列技術檢測40個呼吸道樣本中的呼吸合胞病毒、副流感病毒、鼻病毒、冠狀病毒和流感病毒，檢出率分別為2.5%、7.5%、10%、2.5%、0%，證實此技術可同時檢測多種呼吸道病毒[35]。

4.4微球體懸浮芯片技術 微球體懸浮芯片技術又稱為液相芯片技術，是一種芯片技術與流式細胞術相結合的新技術。微球體懸浮芯片是微球體單元集合。微球體單元標記特異探針和特異熒光，待測樣本標記另一種熒光，檢測時，樣本中的目標分子與探針結合。流式細胞儀通過微球體上的熒光來實現對目標分子的檢測。目前已有多種商業化試劑盒。Joan-Miquel等將常用的 ResPlex II Panel v2.0 (Qiagen), MultiCode-PLx (EraGen Biosciences), and xTAG (Luminex) 3種試劑盒進行了比較，結果提示ResPlex II可檢測更多病原體，MultiCode-PLx相較之下更為方便，xTAG的靈敏度較高。這些檢測方法共同的不足之處是它們都是開放性平臺，易于產生污染，靈敏度還有待于進一步提高[36]。Sefers SE等建立了同時檢測包括呼吸道合胞病毒、人類偏肺病毒、鼻病毒等12種常見呼吸道病毒的多重PCR聯用懸浮陣列方法，此方法具有快速、高通量的特點[37]。

4.5依賴核酸序列的擴增技術和重組酶聚合酶擴增技術 依賴核酸序列的擴增技術(nucleic acid sequence-based amplification，NASBA)是一種簡單快速的擴增核酸的方法，常用于擴增RNA，擴增過程中不需要熱循環儀，在恒定反應溫度下即可準確擴增目的RNA，1～2 h的孵育，可以使模板擴增109倍[38]。NASBA的反應過程中，靶RNA經逆轉錄酶催化形成RNA-DNA雜交體，在RNA酶作用下雜交體中的RNA被降解，單鏈DNA作為模板合成雙鏈DNA，后者被T7RNA聚合酶不斷轉錄出靶RNA，由此進入新一輪擴增循環，不斷形成靶核酸。擴增產物需基于發光的檢測器進行檢測，其中，酶聯寡核苷酸捕獲光學檢測方法(enzyme-linked oligonucleotide capture，EOC)要比電化學發光檢測有著更好的靈敏度和特異性[39]。Lok Ting Lau等用NASBA-EOC方法建立了同時檢測甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒等9種常見呼吸道感染病毒，檢測線在10-8～10-11之間，相對于PCR檢測技術來說用時更少、通量更高[40]。與NASBA相似，重組酶聚合酶擴增技術(recombinase polymerase amplification，RPA)在恒溫下即可進行反應，不需要熱循環儀。RPA 反應中，重組酶與上下游引物結合，與同源雙鏈 DNA進行鏈交換，單鏈綁定蛋白與親本鏈綁定，阻止其與脫離的模板鏈發生相互作用，然后DNA 聚合酶從上下游引物的 3′端啟動模板合成，形成兩條雙鏈 DNA，如此循環重復進行擴增[41]。RPA 方法操作簡單，耗時短，無需昂貴的設備及相關的專業培訓，在檢測的靈敏性和特異性上與熒光定量 PCR 相當。在呼吸道疾病病原體檢測的應用上已有少量單種病原體的檢測[42]，但鮮有同時測定多種下呼吸道病原體方法建立的報導。

4.6雙光子熒光激發mariPOC○RMariPOC○R是一種用于檢測呼吸道合胞病毒、腺病毒、流感病毒A、B型、副流感病毒Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ型、人類偏肺病毒及肺炎鏈球菌病原體的抗原檢測試劑盒。檢測過程中，病原體在聚苯乙烯微粒上形成單克隆抗體-抗原-標記的單克隆抗體的免疫復合物，采用免疫熒光檢測儀檢測其熒光信號。M. Gunell等用mariPOC○R技術檢測了共224 585個樣品，6 897個樣本檢出陽性，并提出此技術可用于臨床診斷[43]。鄭琦等利用此技術檢測人類偏肺病毒、腺病毒、肺炎鏈球菌等8種病原體，335例臨床標本中的7種呼吸道病毒經mariPOC○R法、DFA 鏡檢法檢測，總陽性率分別為38.21%和37.31%，一致率為98.4%，表現出比直接免疫熒光法更高的陽性率及快速、智能的特點[44]。

4.716S-Meta分析和宏基因組技術 16S-Meta分析和宏基因技術不依賴于病原體的分離和純化，可以實現對微生物進行快速、微量、準確簡便地分類鑒定和檢測，在臨床和實驗室病原體檢測中具有巨大的應用潛力[45]。16S-meta分析僅限于對細菌的檢測，是將樣本總DNA提取后擴增細菌16S區域，測序完成后可分析樣本中病原體的組成、多樣性及進化關系。測序技術運用第2代和第3代測序技術，其中第2代測序技術主要包括Illumina公司的Solexa測序技術、羅氏公司的454測序技術和ABI公司的SOLiD測序技術，以檢測細菌16S區域的某個或某幾個高變區來進行鑒定，具有高通量、低成本的特點。由于測序讀長較短，2代測序的方法一般僅能鑒定到屬水平。Kehrmann J等用Illumina平臺的第2代測序技術對肺囊蟲病患者和未患肺囊蟲病患者肺泡灌洗液進行了檢測，發現二者屬水平上的微生物組成主要有葡萄球菌，腸球菌，鏈球菌，埃希氏菌屬，沙雷菌屬，乳桿菌屬，韋榮球菌，奈瑟菌屬和普雷沃氏菌，未能觀察到兩種樣本之間存在顯著差異[46]。隨著3代測序逐漸興起，其不需PCR富集序列，在高通量測序的基礎上可以測更長的序列，有效避免樣本序列信息丟失的問題。對細菌16S全長測序，更有利于對樣本中微生物到種水平的鑒定，測序技術主要有Helicos公司的Heliscope單分子測序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術，Ian Toma等利用Pacific Biosciences平臺對27份疑似肺炎患者的呼吸道樣本進行檢測，在與微生物分離培養方法比較中發現，有12個樣本的檢測結果有高度一致性，3個樣本檢測結果高度不一致，另有7個樣本未能分離出病原體但在三代測序技術中有微生物檢出，提示通過基于長序列測序的方法提供的診斷準確性顯著提高[47]。宏基因組技術是對樣本中所有微生物的全基因序列進行測序，可以更準確的鑒定到細菌、真菌、病毒等各種病原體的種水平，可進行更深層的基因注釋和功能注釋，在爆發流行分析和監測、院感控制和少見、新病原鑒定方面具有突出優勢。楚亞男等利用對肺炎病人支氣管肺泡灌洗液的全基因序列進行454焦磷酸測序，鑒定了20種呼吸道重癥感染相關細菌物種，發現了兩種呼吸道潛在致病菌microbacteriumlaevaniformans和borreliagarinii，檢測到4種耐藥基因和6種細菌侵染所需的毒力因子，為臨床上快速診斷和合理用藥提供了依據[48]。

表2 16S-meta分析和宏基因組技術比較及2代和3代測序比較Tab.2 Comparison of 16S-meta analysis and metagenomic technology and comparison of second and third generation sequencing

5 總結與展望

分離培養與涂片鏡檢法是臨床治療的重要參考，二者結合對實驗室診斷更具有重要意義。雖然分離培養操作過程復雜、所耗時間長、檢出限制條件多，但仍然是檢驗方法中的“金標準”。血清學方法也是下呼吸道病原體檢測的重要方法之一，但難以避免會出現假陽性結果，影響診斷和病情。而分子生物學技術的發展日新月異，以分子生物學為基礎的多種下呼吸道病原體同時檢測的方法具備特異性強、敏感性高、通量高、速度快、省時、省力的優點，尤其是宏基因組技術的蓬勃發展，研究層次深和通量高的特點更是病原體檢測的主流，因此分子生物學檢測將成為最重要的檢測方法。隨著科技的發展，高度自動化的操作和多種病原體快速、高通量檢測的結合，更能應對突發公共衛生事件，更能迎合個性化治療的精準醫學理念，可能成為未來下呼吸道病原體檢測技術發展的趨勢[49]。