不同疾病標本中銅綠假單胞菌分離鑒定與多重耐藥性分析

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銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)俗稱綠膿桿菌，廣泛分布于自然界、人體皮膚與腸道以及多種醫療器械表面[1-2]。銅綠假單胞菌是常見機會致病菌(opportunistic pathogen)，也是引起醫院感染主要病原菌之一[2-5]。有文獻報道，銅綠假單胞菌感染引起的疾病類型復雜多樣，但以肺部感染最為常見[6-9]。此外，銅綠假單胞菌對多種臨床常用抗生素天然耐藥[10-12]。為了解不同疾病銅綠假單胞菌的感染狀況以及該菌對臨床常用抗菌藥物的耐藥性，我們對2017年本院急診或住院細菌性感染病人標本中銅綠假單胞菌進行了分離鑒定并檢測和分析了分離菌株的耐藥性，另選擇僅檢出銅綠假單胞菌的患者進行了年齡和性別與易感性、所致疾病類型、病人臨床科室來源等進行了分析，以期為更有效地診治銅綠假單胞菌感染性疾病提供依據。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集859例2017年1—12月來本院急診或住院感染性疾病病人痰液、腹水、尿液、切口分泌物或血液等標本。

1.2細菌分離培養 根據《全國臨床檢驗操作規程》第4版規程[13]，將不同臨床標本分離劃線接種圖血平板(法國生物梅里埃)和巧克力平板(法國生物梅里埃)上，倒置平板在5% CO2環境中37 ℃培養18～24 h，以獲得單個菌落。

1.3細菌鑒定 根據《全國臨床檢驗操作規程》第4版規程[13]，單個菌落增菌培養后采用VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀(法國梅里埃)公司及GN鑒定卡進行鑒定。

1.4PCR 采用銅綠假單胞菌16S RNA基因特異性引物和EX-Taq高保真PCR試劑盒(TaKaRa，大連)[14]，對標本中僅有銅綠假單胞菌的分離出鑒定進行PCR檢測。采用細菌基因組DNA提取試劑盒(Axygen，USA)提取各銅綠假單胞菌分離株基因組DNA，紫外分光光度法測定其濃度和純度[15]。上游27F引物序列：5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′，下游1492R引物序列：GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′。引物由上海Invitrogen公司合成。PCR參數如下：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s進行35個循環，72 ℃ 10 min。采用溴乙錠預染色的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，銅綠假單胞菌特異性擴增片段大小為1425 bp[14]。PCR中以銅綠假單胞菌ATCC27853株為對照。

1.5藥物敏感試驗 根據《全國臨床檢驗操作規程》第4版規程[13]，采用法國生物梅里埃公司VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀及AST-GN藥敏卡，檢測上述銅綠假單胞菌臨床分離菌株對14種抗菌藥物的敏感性。根據美國臨床標準化委員會(CLSI)規程[16]，采用K-B紙片擴散法檢測銅綠假單胞菌臨床分離菌株對美諾培南、米諾環素、哌拉西林的敏感性。上述藥物敏感試驗中，銅綠假單胞菌ATCC27853株作為質控菌株。根據CLSI標準判讀藥物敏感試驗結果[16]。

1.6多重耐藥模式分析 根據文獻，銅綠假單胞菌多重耐藥是指該菌對3類及以上不同類型至少1種抗菌藥物耐藥，其中β-內酰胺類抗生素又分為青霉素、頭孢菌素和碳青酶烯3類[17]。根據上述標準，對銅綠假單胞菌臨床菌株多重耐藥模式進行分析。

1.7統計分析 采用卡方檢驗分析銅綠假單胞菌臨床分離菌株對不同抗菌藥物的耐藥率和多重耐藥模式，P<0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1銅綠假單胞菌PCR檢測結果 199例銅綠假單胞菌基因組DNA中，均能擴增出預期大小的目的基因片段(1 425 bp)，表明VITEK-2 Compact全自動細菌鑒定儀及GN鑒定卡鑒定結果可靠(圖1)。

M：分子量marker；1：空白對照；2：銅綠假單胞菌ATCC27853株擴增條帶(對照)；3～6：4株銅綠假單胞菌臨床分離代表株擴增條帶

2.2銅綠假單胞菌所致疾病類型 199例銅綠假單胞菌感染病人中，以肺炎等下呼吸道感染最為常見(35.7%，71/199)(χ2=24.8,P<0.05)，其次為皮膚感染(14.1%，28/199)、腹腔感染(13.1%，26/199)、泌尿道感染(13.1%，26/199)、上呼吸道感染(10.0%，20/199)和膽道感染(7.5%，15/199)(χ2=4.0,P<0.05)，耳道、血液和其他感染僅占7.5%(15/199)(表1)。

表1 銅綠假單胞菌感染性疾病類型及其構成比Tab.1 Types and constituent ratios of P. aeruginosa-infected diseases

2.3性別與年齡對銅綠假單胞菌感染率的影響 199例銅綠假單胞菌感染病人中，62.8%(125/199)為男性，37.2%(74/199)為女性，男性更易感(χ2=26.1,P<0.05)。病人年齡范圍22～97歲，其中69.3%(138/199)病人≥60歲、21.1%(42/199)病人41～59歲、9.6%(19/199)病人20～40歲，≥60歲人群更易感(χ2=59.5,P<0.05)；各病種中泌尿系統、下呼吸道和皮膚感染率相對較高(>70%)，但20～40歲病人耳道感染較為常見(表2)。

2.4銅綠假單胞菌感染病人臨床科室分布 199例銅綠假單胞菌感染患者中，27%(54/199)來自重癥監護病房、26%(51/199)來自普外科，多于其他科室(χ2=17.7,P<0.05)(表3)。

2.5銅綠假單胞菌臨床菌株耐藥性 藥物敏感試驗結果顯示，199株銅綠假單胞菌臨床菌株對妥布霉素和丁胺卡那霉素敏感率分別為95.48%和93.47%，其次為慶大霉素(88.44%)、左旋氧氟沙星(72.36%)和哌拉西林(70.51%)，但對復方新諾明、頭孢唑林、氨芐西林、氨芐西林/舒巴坦、米諾環素、頭孢曲松耐藥率較高，分別為99.50%、98.99%、98.48%、97.99%、97.80%和95.48%(表4)。

表3 銅綠假單胞菌感染病人臨床科室分布Tab.3 Distribution in clinical departments of P. aeruginosa-infected patients

表4 銅綠假單胞菌臨床菌株藥物敏感試驗結果Tab.4 Results of drug sensitivity test of P. aeruginosa isolates

2.6銅綠假單胞菌臨床菌株多重耐藥模式 四環素類米諾環素和磺胺類復方新諾明臨床使用較少。除米諾環素和復方新諾明外，55.3%銅綠假單胞菌臨床分離菌株(110/199)株多重耐藥，多重耐藥模式復雜多樣，其中30.9%(34/110)菌株對青霉素+頭孢菌素+碳青霉烯類耐藥，39.1%(43/110)菌株對青霉素+頭孢菌素+碳青霉烯+喹諾酮類耐藥，為銅綠假單胞菌優勢多重耐藥模式(χ2=25.1,P<0.05)(表5)。

3 討 論

銅綠假單胞菌為革蘭陰性桿菌，分布廣泛，是最為常見的機會致病菌和醫院感染病原菌之一。盡管銅綠假單胞菌感染所致疾病復雜多樣，但國內外研究報道，肺炎是銅綠假單胞菌感染所致主要疾病[18-20]。本研究中，高達35.7%病人為銅綠假單胞菌下呼吸道感染，其中66例為肺炎、5例為慢性阻塞性肺病，氣管插管和氣管切開后使用呼吸機等有創醫療措施增加了銅綠假單胞菌下呼吸道感染風險，與國內外文獻報道一致。值得關注的是，本研究中分別有14.1%、13.1%和12.1%病人分別為銅綠假單胞菌皮膚、腹腔和泌尿道感染，皮膚感染者多有下肢靜脈曲張所致慢性潰瘍、腹腔感染者多為腹腔鏡術后感染、泌尿道感染者多發生于膀胱切除術或更換輸尿管支架后。上述資料提示，在醫院日常醫療工作中，加強環境空氣和醫療器材消毒、減少和治愈皮膚損傷、加強術中消毒并在術后預防性使用抗菌藥物，是降低銅綠假單胞菌感染的有效措施。

表5 綠假單胞菌臨床菌株多重耐藥模式Tab.5 Multidrug resistance models of P. aeruginosa isolates

本研究中發現，69.3%銅綠假單胞菌感染病人為≥60歲老年人群，疾病類型以泌尿道、下呼吸道和皮膚感染常見。眾所周知，老年人機體免疫力顯著下降，易發生正常菌群所致的機會性感染[21-22]。此外，銅綠假單胞菌感染病人在不同臨床科室中的分布存在明顯差異，ICU(27.1%，54/199)和普外科(25.6%，51/199)銅綠假單胞菌感染病人多于其他臨床科室(P<0.05)，前者多為下呼吸道感染(39/54)，后者多為皮膚和腹腔感染(14+22/51)，這可能與ICU病人因病情重以及抵抗力弱且常施行氣管插管或氣管切開、普外科病人通常進行手術有關。上述資料提示，加強老年人群個人衛生并提高機體免疫力、侵入性醫療時特別注意無菌操作并加強消毒措施，是減少銅綠假單胞菌感染率的針對性措施。

與其他臨床常見病原菌比較，銅綠假單胞菌具有較強的耐藥性，不僅對多種抗菌藥物天然耐藥，且其耐藥機制也復雜多樣[23-24]。根據分子結構和抗菌機制不同，臨床常用抗生素分別為β-內酰胺類(青霉素類哌拉西林和氨芐西林等、一代頭孢菌素類頭孢唑林等、三代頭孢菌素類頭孢他啶和頭孢曲松等、四代頭孢菌素類頭孢吡肟等、碳青酶烯類美羅培南和亞胺培南等)、氨基糖苷類(丁胺卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素等)、喹諾酮類(環丙沙星、左旋氧氟沙星等)和大環內酯類(紅霉素等)。我們的藥物敏感試驗結果顯示，銅綠假單胞菌臨床菌株對氨芐西林、頭孢唑林和頭孢曲松耐藥率高達95.48%～98.99%，但對哌拉西林和頭孢吡肟耐藥率分別僅為28.21%和26.13%，這可能與哌拉西林為抗菌作用較強的半合成青霉素、頭孢吡肟為最新的四代頭孢菌素有關。產生β-內酰胺酶是細菌對β-內酰胺類抗生素耐藥的主要機制，他唑巴坦和舒巴坦均為β-內酰胺酶抑制劑[25]。本研究中發現，銅綠假單胞菌臨床菌株對哌拉西林和氨芐西林耐藥率分別為28.21%和98.48%、對哌拉西林/他唑巴坦和氨芐西林/舒巴坦耐藥率分別為27.13%和97.99%，未能明顯降低細菌對哌拉西林和氨芐西林的耐藥性，提示上述銅綠假單胞菌臨床菌株對哌拉西林和氨芐西林耐藥可能與β-內酰胺酶無關。更為重要的是，55.3%銅綠假單胞菌臨床菌株對臨床常用抗生素多重耐藥，其主要多重耐藥模式為青霉素+頭孢菌素+碳青霉烯類和青霉素+頭孢菌素類+碳青霉烯+喹諾酮類。上述資料提示，銅綠假單胞菌臨床菌株耐藥性強且多重耐藥率較高，故對銅綠假單胞菌感染病人分離菌株并進行藥物敏感試驗極為必要，以期為選擇敏感或相對敏感菌抗生素以及聯合用藥提高銅綠假單胞菌治療效果提供依據。