泡球蚴感染C57BL/6小鼠肝臟CD34表達的動態變化

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泡狀棘球蚴病(AE)簡稱泡球蚴病，是由多房棘球絳蟲的幼蟲寄生于人體從而引發的一種罕見的人畜共患寄生蟲病，主要侵犯在肝臟[1-2]。泡球蚴主要通過直接侵蝕、炎癥刺激、機械性擠壓等方式損害肝組織，以外生性出芽增殖的方式長出新囊泡，然后長入組織內部并最終逐漸波及整個肝臟[3]。Hanahan[4]等研究發現，在腫瘤血管新生過程中會受到“血管生成開關”的調節。CD34是一種高度糖基化跨膜細胞表面的糖蛋白，可通過造血干細胞和祖細胞表達[5]，是血管內皮標記物中標記腫瘤新生血管的指標，具有穩定性和敏感性好的特點[6]。CD34具有血管新生和遷移的生物學功能，因此，被稱為“泛血管內皮細胞標記物”，微血管密度(MVD)是研究腫瘤血管新生常見的指標之一。本研究通過檢測CD34-MVD的表達及動態變化，初步探討血管新生與泡球蚴病程發展的相關性，為以后臨床治療泡型包蟲病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1動物與分組 實驗用種鼠是人工腹腔感染原頭節混懸液18周的子午沙鼠由新疆維吾爾自治區疾控中心提供，實驗用健康清潔型的C57BL/6雌性小鼠，6～8周齡，體質量(18±2)g，購于新疆醫科大學實驗動物中心。運用數字表法將小鼠隨機分成兩組：實驗組20只，對照組20只。

1.2主要試劑與儀器 CD34兔抗單克隆抗體購于英國Abcam公司，即用型免疫組化試劑盒購于北京中杉金橋生物公司，二氨基聯苯胺(DAB)顯色劑和抗體稀釋液均購于丹麥Dako公司。組織自動包埋機(Leica EG1160)及石蠟切片機(Leica 2245)均來自德國Leica公司。光學顯微鏡(CX31RBSF)為日本Olympus公司產品，圖像采集系統(ExwaveHAD)為日本SONY公司產品。

1.3建立模型及標本采集 將人工腹腔感染原頭節混懸液18周的子午沙鼠快速處死，無菌操作并剖腹，取出腹腔中泡球蚴組織，選擇光滑、成簇游離于腹腔或附著在腸系膜、肝表面等部位的泡球蚴組織。用生理鹽水反復沖洗后，將病灶組織剪碎、研磨、過篩網，再用生理鹽水反復漂洗，最終配成濃度為20%的原頭節混懸液。用0.5%伊紅染色見泡狀棘球蚴原頭節3～5個/視野，結構清晰，著色率<15%，加青霉素、鏈霉素注射液各250 u/mL，用于動物接種。將40只C57小鼠麻醉，酒精消毒上腹部皮膚，開腹約0.5 cm，肉眼直視下1號針頭左肝葉穿刺，實驗組注入0.1 mL原頭節混懸液/只(約400只活的原頭節)，對照組注入等量0.1 mL PBS溶液/只，絲線縫合后關閉腹腔，烤燈照射等待復蘇，醒后先禁食12 h，然后恢復正常飲食，飼養于清潔級動物房。分別于感染后30 d、60 d、90 d、120 d每組隨機取5只小鼠，實驗組取病灶及病灶周圍肝組織，對照組取相應部位肝組織。

1.4病理組織學觀察 將上述組織標本置于10%的多聚甲醛溶液固定24～48 h后，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟及石蠟包埋。5 m厚度連續切片。HE染色，光學顯微鏡下觀察各標本組織病理學改變。

1.5免疫組織化學染色檢測CD34的表達 將制備好的石蠟切片烤箱復溫，脫蠟至水化，枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)高壓修復10 min,自然冷卻至室溫。然后3%H2O2溶液室溫孵育10 min,1×PBS振洗(5 min×3次)，每個標本滴加約50 μL一抗稀釋液(CD34工作濃度為1∶2 500)，4 ℃冰箱孵育過夜。次日溫箱復溫后1×PBS振洗(5 min×3次)，每張切片滴加約50 μL二抗稀釋液，溫箱孵育30 min后，1×PBS振洗(5 min×3次)，DAB顯色，蘇木素復染，酸酒精分化，自來水藍化，脫水，透明，自然晾干切片后封片并做好標記。陰性對照用PBS替代一抗，陽性對照用人乳腺癌組織。

2 結 果

2.1肝臟大體觀察 小鼠感染泡球蚴后，30 d時可見直徑約3 mm的乳白色結節狀泡球蚴組織，形態不規則；60 d泡球蚴體積略有增大，在肝葉邊緣生長；90 d時一側肝葉和第一肝門臟面兩處可見明顯的不規則的長條狀組織；120 d時，泡球蚴組織較之前明顯增長，并向肝組織內部不斷滲入，呈浸潤性生長，表現為結節性或巨塊型。對照組小鼠肝臟無明顯改變。

圖1 不同時間點小鼠肝臟泡球蚴感染情況 (黑色箭頭所指為泡球蚴組織)Fig.1 Infection conditions of different time points in Em-infected livers of mice (The black arrows indicated Em tissues)

2.2病理組織學 HE染色顯示實驗組小鼠感染泡球蚴30 d后出現外周炎性反應增生帶，伴有嗜酸性粒細胞浸潤、結核樣肉芽組織形成和纖維組織增生，并可見數個原頭節；感染60 d可見炎性細胞浸潤逐漸加重，外周區域增生較為活躍，向周圍肝組織侵蝕，肝臟原有組織結構部分被破壞；感染90 d時炎性反應增生帶不斷擴增，炎性細胞浸潤愈加嚴重，出現與淋巴細胞、巨噬細胞、漿細胞和嗜酸性粒細胞等炎性浸潤相關的細胞增殖；感染120 d后可見泡球蚴纖維囊壁形成，囊壁周圍可見大量的炎性反應增生和肉芽腫組織，直徑約1 cm的壞死空囊腔已形成，外周炎性增生帶進一步蔓延，肝臟病理性改變嚴重。對照組小鼠肝組織結構基本完整，肝細胞形態正常，偶可見少量炎性細胞浸潤。

A:實驗組，B：對照組

2.3免疫組織化學染色 在不同時間點，實驗組肝泡球蚴病變組織中均可見CD34不同程度的表達，陽性定位于泡球蚴組織內皮細胞的包漿。隨著感染時間的延長，實驗組泡球蚴組織CD34的表達呈時間相關性，表現為先升高后下降的趨勢，在90 d時CD34-MVD最高，各時間點比較差異有統計學意義(F=94.63,P<0.001)。在泡球蚴周圍肝組織中可見微量表達，差異無統計學意義(F=3.24,P>0.05)，圖A2示泡球蚴組織炎性反應帶和周圍肝組織交界區域，可形成明顯的反差。在對照組中亦可見微量表達，組內比較無統計學差異(F=1.98,P>0.05)。泡球蚴組和泡球蚴周圍組、對照組三組相比差異有統計學意義(P<0.01)，而泡球蚴周圍組和對照組相比無統計學差異(P>0.05)。見表1。

A1:實驗組Em組織；A2:實驗組Em周圍肝組織；B:對照組

表1 不同時間點不同肝組織CD34-MVD的表達情況(個Tab.1 Expression of CD34-MVD in different time points of different liver tissues

3 討 論

泡狀棘球蚴病又稱為泡型包蟲病,其生長方式除了直接浸潤以外，還可通過血液循環、淋巴等途徑轉移至肺臟、腦等器官，危害極大，泡球蚴的轉移方式類似惡性腫瘤，故有“蟲癌”之稱[3，8]。惡性腫瘤的生長離不開營養的支持，需要血管來輸送，所以血管新生在腫瘤生長、侵襲及轉移中起著重要作用[9]。

CD34是高度糖基化的I型跨膜蛋白，是其家族成員之中的一種單體表面蛋白，可作為檢測MVD的首選標志物[10]。CD34被廣泛認為是血管內皮祖細胞(EPCs)的標記物[11]， 而EPCs是促進血管新生的重要干細胞之一。Siemerink M J[12]等研究表明：mRNA分析顯示CD34陽性的血管內皮細胞與血管新生和遷移等生物學功能有關；CD34陰性的血管內皮細胞主要與增殖相關，該結果說明CD34在血管新生中有促進作用。 Sarmadi S[13]等認為CD34可標記宮頸癌的MVD。另外，CD34+干細胞可促進血管新生[14]；張示杰[15]等研究結果顯示：沙鼠肝泡球蚴組織中CD34-MVD存在不同程度的表達。

本研究結果顯示，在小鼠肝臟感染泡球蚴后，隨著時間延長，其病變部位CD34-MVD的表達高于泡球蚴周圍肝組織和PBS對照組肝組織，且差異均有統計學意義,此結果表明在泡球蚴浸潤性生長過程中血管新生可能是存在的，并且是不斷變化的。通過對實驗組泡球蚴組織內比較可知，隨著病程的發展，CD34的表達水平有所不同。在感染早中期，泡球蚴組織內新生血管可能不斷增加,在感染晚期，隨著泡球蚴病程的發展，其病變部位CD34-MVD呈現降低趨勢，并且在組織內部可見壞死組織和空囊泡，其原因可能與血管壁慢性炎癥以及管壁內膜增厚導致的血流受阻有關，壞死原因可能是囊內毒素外溢、抗原抗體反應所造成的[16]。Dematteis S[17]、Wang J[18]等學者研究表明，在棘球蚴感染早期，Th1細胞占主導，淋巴細胞功能較強，對棘球蚴的生長和轉移有抑制作用；到后期，Th2細胞占主導，淋巴細胞功能逐漸降低，細胞免疫反應受到抑制，故包蟲可在體內生存，增殖速度加快。本實驗研究泡球蚴生長變化與其基本符合，即早期增長相對緩慢，晚期增長較為迅速，但仍需大樣本研究進一步證實?？梢娫诟腥局衅?90d)是免疫過渡期，即為機體免疫應答由Th1細胞介導的細胞免疫轉變為Th2細胞介導的體液免疫[19]。由上可知，泡球蚴在感染早期，可能由于新生血管的不斷增加，有營養供應，但是由于Th1的作用較強，對其生長和轉移有抑制作用，故蟲體增長不明顯；而在中晚期，Th2作用逐漸變強，宿主對其抑制作用減弱，雖然新生血管減少，但也能夠維持蟲體長期生長，同時肝臟大量分泌的TGF-β1促進肝纖維化后包裹蟲體，有助于泡球蚴免疫逃逸[20]。

總之，本實驗研究表明，小鼠肝泡球蚴感染病程中，CD34的表達呈先升高后降低趨勢，并且在90d時達到峰值，這說明在泡球蚴生長過程中很可能伴隨著血管新生，血管新生可能為其生長重要的機制之一,同時，MVD可能在泡球蚴病程中起著重要作用。本研究為臨床泡型包蟲病的抗血管化治療奠定了基礎。