山東省2017—2018年B型流感病毒藥物敏感性檢測(cè)及神經(jīng)氨酸酶基因特征分析

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流行性感冒(流感)是呼吸道傳播的傳染性疾病，可造成世界范圍內(nèi)的廣泛流行，據(jù)估計(jì)每年流感流行導(dǎo)致全球近50萬人死亡，是第一個(gè)實(shí)行全球性監(jiān)測(cè)的傳染病[1]。根據(jù)流感病毒內(nèi)部蛋白抗原性的不同，可分為A、B、C三個(gè)型。B型流感病毒有其獨(dú)特的演化特點(diǎn)，包括編碼蛋白NB、蛋白長(zhǎng)度和基因組的非編碼區(qū)的長(zhǎng)度等[2]。

自1983年以來，B型流感病毒根據(jù)其抗原性和基因特性分為兩大譜系，簡(jiǎn)稱為Yamagata系和Victoria系[3]。與A型流感病毒相比，B型更傾向于在兒童和老年人群體中流行，常導(dǎo)致多種并發(fā)癥和死亡病例，疾病負(fù)擔(dān)甚至超過A型[4-5]。目前，應(yīng)用于臨床抗流感病毒藥物主要分為兩類: 一類為M2離子通道抑制劑，也稱金剛烷胺類；另一類為神經(jīng)氨酸酶抑制劑(NAI)，如奧司他韋、扎那米韋等。由于B型流感病毒缺乏M2蛋白，因此僅有神經(jīng)氨酸酶抑制劑對(duì)其有效[6]。在NA活性部位或者鄰近活性部位的氨基酸發(fā)生替換就有可能導(dǎo)致病毒對(duì)NAI的敏感性降低，影響NAI的治療效果。目前，很少見到國內(nèi)關(guān)于耐藥毒株的報(bào)道。

本研究分析了2017-2018流感監(jiān)測(cè)年度山東省B型流感病毒對(duì)神經(jīng)氨酸酶抑制劑的藥物敏感性，同時(shí)分析了B型流感病毒NA基因的分子進(jìn)化及耐藥突變位點(diǎn)，為山東省B型流感的防控提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1毒株來源 所有流感毒株均來自山東省流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室。依據(jù)《全國流感監(jiān)測(cè)方案(2017版)》，每年4月1日所在周至次年4月1日所在周前一周為一個(gè)流感監(jiān)測(cè)年度，因此2017-2018流感監(jiān)測(cè)年度流感毒株的采樣日期為2017年4月3日至2018年4月1日。在此期間，山東省疾控中心收檢B型流感病毒1664株(Yamagata系1646株，Victoria系18株)。Yamagata系病毒在B型流感病毒中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。根據(jù)病毒的采樣日期和分離地點(diǎn)隨機(jī)選取了16株Yamagata系和2株Victoria系病毒用于本研究。神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)中使用的藥物敏感參考毒株B/Rochester/02/2001(D198)和耐藥參考毒株B/Rochester/02/2001(D198N)均由中國疾病預(yù)防控制中心提供。

1.2神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn) 利用ABI公司的NA-FluorTMInfluenza Neuraminidase Assay Kit，采用熒光法對(duì)病毒進(jìn)行生物學(xué)耐藥試驗(yàn)[7-8]。實(shí)驗(yàn)中使用的奧司他韋和扎那米韋由中國疾控中心提供。使用GraphPad Prism 5計(jì)算半數(shù)抑制濃度IC50(神經(jīng)氨酸酶活性被抑制50%時(shí)的藥物濃度)。對(duì)參考毒株進(jìn)行3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后取其平均值作為參考株的IC50值。

根據(jù)WHO制定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判斷：對(duì)于B型流感病毒，當(dāng)待檢病毒IC50值<5倍NAI敏感株的參考株IC50值時(shí)則表示病毒對(duì)所檢測(cè)的NAI藥物敏感；當(dāng)5倍NAI敏感株的參考株IC50值≤待檢病毒IC50值≤50倍NAI敏感株的參考株IC50值時(shí)則表示病毒對(duì)所檢測(cè)的NAI藥物敏感性降低；當(dāng)待檢病毒IC50值>50倍NAI敏感株的參考株IC50值時(shí)則表示病毒對(duì)所檢測(cè)的NAI藥物敏感性高度降低[9]。

1.3 序列測(cè)定及分析

1.3.1核酸提取及神經(jīng)氨酸酶基因擴(kuò)增 所有參與耐藥實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的流感病毒，均使用Qiagen公司的QIAamp Viral RNA Mini Kit試劑盒(Lot 74104)對(duì)流感病毒細(xì)胞培養(yǎng)液進(jìn)行核酸提取，然后用Qiagen公司One Step RT-PCR Kit(Lot 210212)進(jìn)行基因擴(kuò)增。擴(kuò)增引物由國家流感中心提供，序列如下(5′-3′)：

Fragment 1 BNA 1-F AGCAGAAGCAGAGC-ATCTTC，BNA 1-R GATAACAATYTCCYCCGATGC，

Fragment 2 BNA 2-F AAGAAAGTGCYTG-YAATTGCA，BNA 2-R AGTAGTAACAAGAGCAT

PCR反應(yīng)條件：60 ℃ 1 min；42 ℃ 20 min；50 ℃ 20 min；95 ℃ 15 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循環(huán)35次；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.3.2序列測(cè)定及分析 PCR產(chǎn)物送上海博杰生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行雙向測(cè)定。使用SeqMan軟件進(jìn)行序列拼接，選取2017年WHO推薦的北半球流感疫苗株(B/Brisbane/60/2008(Victoria)，B/Phuket/3073/2013(Yamagata))作為參考株進(jìn)行序列分析。使用MEGA5.1軟件對(duì)病毒NA基因的核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)并建立遺傳進(jìn)化樹，對(duì)氨基酸序列進(jìn)行耐藥突變位點(diǎn)分析。

2 結(jié) 果

2.1B型Yamagata系流感病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)結(jié)果 在檢測(cè)的16株B型Yamagata系流感病毒中，15株病毒均為奧司他韋及扎那米韋的敏感株。有1株病毒(B/shandong-shibei/11199/2017)對(duì)奧司他韋和扎那米韋2種藥物的敏感性均降低。16株B/Yamagata系毒株對(duì)奧司他韋的IC50平均值為22.64 nmol/L(9.24～129.31 nmol/L)，其中B/shandong-shibei/11199/2017對(duì)奧司他韋的IC50值為129.31 nmol/L，是B/Rochester/02/2001(D198)藥物敏感參考毒株對(duì)奧司他韋的IC50平均值(14.43 nmol/L)的8.96倍。16株B/Yamagata系毒株對(duì)扎那米韋的IC50平均值為0.57 nmol/L(0.31～2.72 nmol/L)，其中B/shandong-shibei/11199/2017對(duì)扎那米韋的IC50值為2.72 nmol/L，是B/Rochester/02/2001(D198)藥物敏感參考毒株對(duì)扎那米韋的IC50平均值(0.37 nmol/L)的7.35倍。耐藥變異株B/Rochester/02/2001(D198N)對(duì)奧司他韋和扎那米韋的IC50平均值分別為146.07 nmol/L和3.91 nmol/L。見圖1。

2.2B型Victoria系流感病毒的神經(jīng)氨酸酶抑制試驗(yàn)結(jié)果 對(duì)奧司他韋敏感的2株B/Victoria系毒株，IC50平均值為14.66 nmol/L(9.24～20.08 nmol/L)，沒有檢測(cè)到對(duì)奧司他韋敏感性降低或者敏感性高度降低的毒株。對(duì)扎那米韋敏感的2株B/Victoria系毒株，IC50平均值為0.41 nmol/L(0.39～0.44 nmol/L)。沒有檢測(cè)到對(duì)扎那米韋敏感性降低或者敏感性高度降低的毒株。見圖1。

2.3NA分子進(jìn)化樹以及NA基因氨基酸位點(diǎn)分析

2.3.1NA基因遺傳進(jìn)化分析 氨基酸序列分析顯示，與國際疫苗株B/Phuket/3073/2013(Yamagata)相比，16株BY系毒株NA片段共有16處位點(diǎn)發(fā)生變異；2株BV系毒株與國際疫苗株B/Brisbane/60/2008(Victoria)相比，NA片段有5處位點(diǎn)發(fā)生變異。如表1，2所示。圖2為構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹，NA基因進(jìn)化樹分為Yamagata系和Victoria系

兩大支。其中Yamagata系分支又分為兩支，B/shandong-huancui/1691/2017等3株病毒與疫苗株B/Phuket/3073/2013距離較近，其余13株病毒距離疫苗株相對(duì)較遠(yuǎn)。

注：左縱坐標(biāo)為流感毒株對(duì)奧司他韋的IC50值，右縱坐標(biāo)為流感毒株對(duì)扎納米韋的IC50值。1：藥物敏感株B/Rochester/02/2001(D198)，2、3：B型Victoria系毒株，分別對(duì)應(yīng)B/shandong-qixia/36/2017和 B/shandong-huancui/1162/2018，4-19：B型Yamagata系毒株，分別對(duì)應(yīng)表1中從B/shandong-bincheng/3228/2017到B/shandong-shibei/11199/2017(順序從上到下)，20為藥物敏感株B/Rochester/02/2001(D198)的5倍IC50值。

表1 2017-2018年度山東省B型Yamagata系分離株NA氨基酸位點(diǎn)的變化Tab.1 Amino acid mutations in NA proteins of BY lineage influenza viruses in Shandong, 2017-2018

*為2017年世界衛(wèi)生組織規(guī)定的疫苗株

●：疫苗株●：Vaccine virus

表2 2017-2018年度山東省B型 Victoria系分離株NA氨基酸位點(diǎn)的變化Tab.2 Amino acid mutations in NA proteins of BV lineage influenza viruses in Shandong, 2017-2018

2.3.2NA蛋白分子上耐藥突變位點(diǎn)的變異情況 流感病毒對(duì)NAI類藥物產(chǎn)生耐藥主要是由于HA的受體結(jié)合位點(diǎn)以及NA催化活性中心的位點(diǎn)突變所致。NA酶活性區(qū)域由功能部位8個(gè)氨基酸(R-118，D-151，R-152，R-224，E-276，R-292，R-371，Y-406)和結(jié)構(gòu)部位11個(gè)氨基酸(E-119，R-156，W-178，S-179，D-198，I-222，E-227，H-274，E-277，N-294和E-425)。這些氨基酸在A型和B型流感病毒中均為保守氨基酸，導(dǎo)致NA酶活性區(qū)域或者結(jié)構(gòu)部位發(fā)生構(gòu)象變異的突變會(huì)影響病毒對(duì)NAI的敏感性[10]。序列比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，所測(cè)得的毒株NA基因氨基酸序列只有B/shandong-shibei/11199/2017這一株發(fā)生H274Y突變，其他毒株上述位點(diǎn)均保守?zé)o突變。這與耐藥實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致，耐藥實(shí)驗(yàn)也證實(shí)這些毒株仍然對(duì)NAI類藥物敏感，B/shandong-shibei/11199/2017株的對(duì)奧司他韋和扎那米韋2種藥物的敏感性均降低。

3 討 論

一直以來，人們對(duì)B型流感缺乏足夠的重視，但是近來的監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示B型流感所帶來流行和死亡的疾病負(fù)擔(dān)高于人們的傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)[11]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，從2004年以來B型流感病毒導(dǎo)致了1%～52%的流感相關(guān)的兒童死亡率[12]。人們應(yīng)對(duì)B型流感病毒予以更多的關(guān)注。

流感病毒NA是流感病毒重要的表面糖蛋白，具有抗原性，其功能是催化裂解唾液酸使子代病毒釋放并防止病毒形成聚集體[13]。NAI作為唾液酸類似物能夠通過與NA結(jié)合而阻斷NA與唾液酸的結(jié)合，從而抑制流感病毒的NA活性[14]。隨著NAI的廣泛使用，一些流感病毒的NA活性位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生突變，降低了病毒與NAI的結(jié)合能力，進(jìn)而導(dǎo)致病毒對(duì)NAI的敏感性降低，使病毒更有利于生存，從而加速病毒的進(jìn)化速率。本次研究發(fā)現(xiàn)，山東省B/Yamagata系毒株相對(duì)B/Victoria系毒株對(duì)奧司他韋和扎那米韋更敏感(B/Victoria系毒株對(duì)奧司他韋和扎那米韋的IC50平均值分別為32.96 nmol/L和1.05 nmol/L，B/Yamagata系毒株對(duì)奧司他韋和扎那米韋的IC50平均值分別為16.66 nmol/ L和0.83 nmol/L)。這與中國疾控中心之前的監(jiān)測(cè)結(jié)果一致[15]。2007-2008年，全球范圍內(nèi)廣泛出現(xiàn)了一種獲得了NA基因H274Y突變的季節(jié)性H1N1流感病毒[16]，表明對(duì)NAI敏感性高度降低的流感病毒可在人群中迅速傳播。本次研究中發(fā)現(xiàn)的一株B/Yamagata系毒株NA基因具有H274Y位點(diǎn)突變，導(dǎo)致其對(duì)奧司他韋和扎那米韋均出現(xiàn)敏感性降低，提示該位點(diǎn)在NA酶活性區(qū)域與NAI結(jié)合上具有重要作用。2017-2018流感監(jiān)測(cè)年度我省Victoria系流感病毒活動(dòng)水平較低，主要以Yamagata系為主，而WHO推薦的疫苗組分是Victoria系病毒。由于Yamagata系和Victoria系流感病毒之間缺乏交叉保護(hù)，所以本年度WHO推薦的B型流感疫苗組分與我省B型流感優(yōu)勢(shì)流行株匹配性不佳。造成這種問題的主要原因是目前對(duì)流感流行型別的預(yù)測(cè)還無法做到很精準(zhǔn)。隨著將來四價(jià)流感疫苗的上市，這一問題可以得到解決。

本次研究顯示，目前我省B型流感病毒對(duì)NAI的耐藥比例維持在很低的水平，我省在臨床上使用NAI治療和預(yù)防B型流感病毒是有效的。由于本次研究檢測(cè)病毒數(shù)量較少，難以得出全面結(jié)論。我們?nèi)孕鑼?duì)流感病毒進(jìn)行長(zhǎng)期、持續(xù)的耐藥性監(jiān)測(cè)，以便能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)對(duì)藥物敏感性降低的毒株，為本省流感的防控以及臨床用藥提供依據(jù)。