杜仲內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物多糖的體外細(xì)胞毒活性篩選

岑娟 張峰

摘 ?要：目的 ?該文對(duì)從杜仲內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)生的多糖成分進(jìn)行體外細(xì)胞毒活性篩選。方法 ?采用MTT法，用杜仲內(nèi)生真菌多糖對(duì)7種腫瘤細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)。結(jié)果 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，杜仲內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖成分對(duì)HL-7702和Hela腫瘤細(xì)胞的IC50值分別為17.493.91和9.5216.24。結(jié)論 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明杜仲內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物杜仲多糖對(duì)部分腫瘤細(xì)胞具有一定的細(xì)胞毒作用。

關(guān)鍵詞：杜仲 ?內(nèi)生真菌 ?抑菌作用

中圖分類(lèi)號(hào)：S567 ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2019）12（c）-0156-02

植物內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物豐富多樣，活性作用也不盡相同，具有抗菌、抗氧化、抗腫瘤、殺蟲(chóng)和免疫抑制等生物活性，有一些內(nèi)生菌還能產(chǎn)生活性物質(zhì)，與宿主植物藥用成分相同。所以，在活性物質(zhì)篩選和新藥研發(fā)方面，內(nèi)生菌具有無(wú)窮潛力[1]。2003年，李雅等人[2]最早開(kāi)始了對(duì)杜仲內(nèi)生菌的研究，他們采用WA-抗生素培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基，從采自陜西楊凌的杜仲各個(gè)組織中分離到了49株內(nèi)生真菌。然后，用蘋(píng)果腐爛病菌（Cyt-osporasp）作為致病菌株，對(duì)分離到的這49株內(nèi)生真菌進(jìn)行了抗菌活性測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有22株菌株對(duì)至少3種致病菌有顯著的抑制作用。Chen等人[3]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)從四川成都杜仲葉和樹(shù)皮中分離得到的29株內(nèi)生真菌進(jìn)行抗菌活性篩選后，發(fā)現(xiàn)大部分內(nèi)生真菌都可以抑制供試病原細(xì)菌，但是抑制供試病原真菌的效果不太顯著。丁婷等人[4]研究發(fā)現(xiàn)，從杜仲中分離出32株內(nèi)生真菌中，屬于梭孢殼屬的內(nèi)生真菌DGS08對(duì)玉米紋枯病菌的生長(zhǎng)有很好的抑制作用。該文對(duì)篩選出得杜仲內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物多糖進(jìn)行抗腫瘤活性篩選。

1 ?材料

1.1 試劑

青鏈霉素混合液（Solarbio），DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco），優(yōu)級(jí)胎牛血清（tbd science），二甲基亞砜（DMSO）（天津市富宇精細(xì)化工有限公司），四甲基噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma）;胰蛋白酶（Trypsin）美國(guó)Amresco公司。

1.2 細(xì)胞株

MCF-7（人乳腺癌細(xì)胞株），K562（人慢性髓系白血?。?，HeLa（人宮頸癌），A549（肺腺癌細(xì)胞株），SMMC-7721（人肝癌細(xì)胞），HepG-2（人肝癌細(xì)胞系），MDA-MB-231（人高轉(zhuǎn)移性惡性乳腺癌細(xì)胞）：南京凱基生物技術(shù)股份有限公司。

HL-7702（正常人肝細(xì)胞）：中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.3 儀器

500-831型全長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Fisher Scientific），2424-2型CO2培養(yǎng)箱（上?？迫鹕锛夹g(shù)有限公司），TDL-50B型低速臺(tái)式離心機(jī)（舜宇儀器有限公司），JJ-CJ-2FD超凈化工作臺(tái)（吳江市凈化設(shè)備總廠產(chǎn)品）。

2 ?實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞的培養(yǎng)

將MCF-7、SMMC-7721、MDA-MB-231、K562、HL-7702、HeLa、HepG-2、A549在37℃，5%CO2條件下用含10%胎牛血清、青霉素1×105U/L及鏈霉素100mg/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞對(duì)數(shù)期。

2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各個(gè)細(xì)胞株按4×105/孔接種到96孔板中，37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24h后設(shè)置正常組（不加化合物），實(shí)驗(yàn)組（100mg/mL、50L、5、1、0.5mg/mL）分別加到96孔板中，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)平行復(fù)孔，繼續(xù)孵育48h后，在避光條件下每孔給予10μLMTT（5mg/mL），繼續(xù)放置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4h后，棄去上清液，每孔加入100μL的DMSO（分析純）溶液，放置于室溫條件下，100rpm的震蕩箱下震蕩10min直至MTT反應(yīng)的藍(lán)色結(jié)晶產(chǎn)物完全溶解，置于多功能酶標(biāo)儀中，設(shè)置570nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)吸光度（Optical Density，OD），讀出OD值帶入公式中，求得細(xì)胞抑制率，并計(jì)算IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

細(xì)胞抑制率%=（1-實(shí)驗(yàn)組OD值/正常組OD值）×100%

3 ?實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表1可知：杜仲多糖對(duì)MCF-7、SMMC-7721、MDA-MB-231、K562、HL-7702、HepG-2細(xì)胞作用48h后，對(duì)細(xì)胞沒(méi)有明顯的抑制率（P>0.05），從表中可以看出杜仲多糖對(duì)HeLa，A549細(xì)胞有明顯的抑制率（P<0.05），IC50值分別為17.49±3.91和9.521±6.24。

由圖1可知，不同濃度的杜仲多糖對(duì)A549細(xì)胞的生長(zhǎng)均有一定的抑制作用。當(dāng)杜仲多糖對(duì)A549細(xì)胞作用48h，濃度在0.5～5mg/mL抑制率波動(dòng)不明顯，但有顯著性差異（P<0.01），隨著多糖濃度的增加，濃度在50mg/mL時(shí)對(duì)細(xì)胞的抑制率明顯增強(qiáng)（P<0.01），而且50mg/mL的時(shí)候抑制率為80%，達(dá)到一個(gè)平臺(tái)期，濃度在100mg/mL時(shí)抑制率為78%。

4 ?討論

在觀察杜仲多糖對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用時(shí)，我們首先采用MTT法來(lái)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以篩選杜仲多糖有效作用濃度范圍及IC50，然后采用MTT法測(cè)定各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。杜仲多糖各組作用HeLa，A549細(xì)胞后，其生長(zhǎng)均受到了顯著的抑制。隨著濃度的升高，抑制率也不斷升高，說(shuō)明藥物的作用具有濃度依賴(lài)性。

近年來(lái)多糖類(lèi)的抗腫瘤作用引起了人們廣泛的注意，除可通過(guò)增強(qiáng)宿主免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用外，多糖還能通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等途徑直接殺傷腫瘤細(xì)胞，從辛?xí)悦鞯膱?bào)道中可以看出杜仲總多糖具有顯著的腫瘤抑制作用，并能夠提高胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)和骨髓有核細(xì)胞計(jì)數(shù)，增強(qiáng)宿主免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用。

參考文獻(xiàn)

[1] 曾松榮，徐成東，王海坤，等.藥用植物內(nèi)生真菌及其具宿主相同活性成分的機(jī)制初探[J].中草藥，2000，31（4）：306-308.

[2] 李雅，宋曉斌，馬養(yǎng)民，等.杜仲內(nèi)生真菌對(duì)植物病原真菌的抑菌活性研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，35（2）：69-73.

[3] Chen XM， Sang YX， Li SH， et al. Studies on a chlorogenic acid-producing endophytic fungi isolated from Eucommia ulmoides Oliver [J].J Ind Microbiol Biotechnol，2010，37（5）：447.

[4] 丁婷，孫微微，韓亞惠，等.杜仲內(nèi)生真菌DZJ07在小麥根際定殖及對(duì)根部酶活的影響[J].核農(nóng)學(xué)報(bào)，2015，29（6）：1149-1157.