轉BpTCP7白樺耐鹽堿能力分析

張 園，李芳蕊，李 洋，許思佳，安琳君，李慧玉

(東北林業大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

我國鹽漬化和次生鹽漬化土地有4000萬hm2以上，占現有耕地的四分之一，而且鹽漬化日趨嚴重，影響到我國農林業的生產。目前，鹽堿地綜合治理主要依靠生物措施，發掘更多的耐鹽植物是當前解決鹽漬化的重要手段。植物耐鹽機制研究的深入及基因工程育種的發展，為培育耐鹽植物特別是林木品種提供了新途徑。

TCP是植物特有的一類轉錄因子。TCP基因家族具60個氨基酸殘基組成的堿性區-螺旋-環-螺旋(bHLH)的TCP保守結構域(TCP domain)[1]。根據其TCP結構域不同分為2個亞家族，ClassⅠ(TCP-P)和ClassⅡ(TCP-C)，BpTCP7屬于ClassⅡ亞類[2]。研究表明，TCP在植物中參與多種植物激素的應答反應，通過偶聯這些激素響應過程來調控植物生長發育過程，如分枝、株高、葉形、花形、種子萌發、維管束生長、配子體發育、光形態建成以及晝夜節律調控。另外，在植物低溫、高鹽等逆境脅迫應答反應中發揮一定的作用[3-10]。

白樺(Betulaplatyphylla)是我國東北地區蓄積量最大的鄉土速生闊葉樹種，也是天然次生林更替的先鋒樹種。前期，通過基因工程育種手段獲得了轉BpTCP7基因過表達白樺植株，本研究以轉TCP7白樺為材料，檢測NaHCO3脅迫后的各轉基因株系的生長量、保護酶類、滲透調劑物及MDA含量等指標，分析其耐鹽堿能力，并篩選抗鹽堿優良的株系，為利用植物改良鹽堿地提供種質資源。

1 材料與方法

1.1 植物材料

2年生轉BpTCP7基因過表達白樺株系4個(分別為TCP7-1，TCP7-2，TCP7-3，TCP7-4)及非轉基因對照株系(WT)。通過組培擴繁，每個株系擴繁50株。選擇規格相同的塑料花盆，裝入等量培養土，將苗木移入盆中，第2年夏，在植物生長旺盛時，株系內選擇生長基本一致的植株用于NaHCO3脅迫處理試驗。

1.2 試驗方法

1.2.1 處理方法 分別選取每個株系各36株，分成3組，每組各12株，每盆1株，分別向盆內澆入1、2、4 g·L-13種不同質量濃度的NaHCO3溶液，以澆入等量清水為對照。每天澆施500 mL·株-1溶液，處理時間為12 d。分別在處理0、3、6、9、12 d時，取植株第3～5片功能葉，每個株系每個處理各采樣20片左右，在液氮條件下充分混合研磨成粉末，進行各指標測定。脅迫處理12 d后，對試驗苗木復水。

1.2.2 指標測定 超氧化物歧化酶(SOD) 活性采用NBT比色法[11]，游離脯氨酸含量采用磺基水楊酸浸提-酸性茚三酮顯色法[12]，丙二醛(MDA)含量采用TBA 比色法[13]。

生長量的測定：鹽處理前和復水20 d分別用塔尺測定主干高度，計算高生長量和相對生長量。高生長量= 處理結束后樹高-處理前樹高；相對生長量=(處理高生長量/對照生長量)×100%。

1.2.3 數據分析與處理 數據統計分析和作圖由Excel和SPSS 16.0軟件系統完成。

2 結果與分析

2.1 NaHCO3脅迫對細胞保護酶活性的影響

SOD是氧自由基代謝的關鍵酶類，可以清除植物體內的自由基，在逆境條件下其活性高低可反映機體的抗逆能力[14]。從圖1A可以看出，在0.2%NaHCO3脅迫3 d后，轉基因及對照株系的SOD活性變化不明顯；6～9 d時，除了TCP7-4外，其他各株系SOD活性逐漸上升；9 d時各株系的SOD活性最高，尤其以TCP7-1最為顯著；隨著脅迫時間進一步延長，各株系SOD活性下降。總體上看，在整個脅迫過程中，轉基因及對照株系的SOD活性差異不顯著。在0.4% NaHCO3處理過程中，3 d開始SOD活性提高，但轉基因與對照株系差異不顯著；6 d時，轉基因株系的SOD活性顯著高于對照株系；9 d開始，各株系的SOD活性下降，除TCP7-3外，其他各轉基因株系的SOD高于對照株系(圖1B)。0.8%NaHCO3脅迫過程中，3 d時，各株系的SOD活性達到了頂峰，TCP7-1、TCP7-2的SOD活性顯著高于對照株系；隨著脅迫時間延長，各株系的SOD活性明顯下降，但大部分時間點轉基因株系的SOD活性均高于對照株系(圖1C)。

圖1 NaHCO3脅迫對轉基因及對照株系的SOD活性的影響

2.2 NaHCO3脅迫對脂膜的影響

MDA為脂膜過氧化的終端產物，其含量多少可以反映生物膜的危害程度，即MDA的含量越高，生物膜損害越嚴重[15]。從圖2A可以看出，低濃度NaHCO3脅迫6 d前，轉基因及對照株系的MDA含量變化均不明顯；脅迫9～12 d時，各株系MDA活性表現出上升的趨勢；在這2個時間點，各轉基因株系的MDA含量均低于對照株系，尤其是TCP7-2株系。在中濃度的NaHCO3處理過程中，6 d時各株系MDA的活性提高，但轉基因與對照株系差異不顯著；脅迫處理9 d時，大部分轉基因株系的MDA活性顯著高于對照株系(圖2B)。高濃度NaHCO3脅迫過程中，各株系的MDA含量隨著脅迫時間的延長逐漸上升，各株系的MDA含量均低于對照株系，尤其是TCP7-4株系(圖3C)。

圖2 NaHCO3脅迫對轉基因及對照株系的MDA含量的影響

2.3 NaHCO3脅迫對滲透調節物質的影響

由圖3A可以看出，在0.2%NaHCO3脅迫3 d時，轉基因及對照株系的脯氨酸含量提高，但各株系間差異不顯著；脅迫6 d時，轉基因株系TCP7-3、TCP7-4顯著高于對照株系；脅迫9 d時，2個轉基因株系的脯氨酸含量下降，與其他各株系間無顯著差異。在0.4%NaHCO3脅迫3 d時，各株系的脯氨酸含量急劇上升，轉基因株系的含量高于對照株系；6 d時，除TCP7-3外，其他各轉基因株系的脯氨酸含量均高于對照株系，并達到最高峰；隨著脅迫時間的繼續延長，脯氨酸含量降低。0.8%NaHCO3脅迫后，3 d及6 d時各株系的脯氨酸含量均上升，除TCP7-1外，其他轉基因株系的上升幅度明顯高于對照株系。

圖3 NaHCO3脅迫對轉基因及對照株系的脯氨酸含量的影響

株系高生長/cm0.2% NaHCO30.4% NaHCO30.8% NaHCO3相對生長量/%0.2% NaHCO30.4% NaHCO30.8% NaHCO3WT13.25±1.25b20.00±1.89b10.80±0.92b---TCP7-18.58±1.33a13.25±1.32a12.67±1.28b6566117TCP7-29.42±1.83a18.17±2.03b18.00±1.24c7191167TCP7-37.58±0.95a17.00±1.75b8.00±0.86a578574TCP7-412.58±1.56b25.50±1.59c26.33±1.98d95128244

2.4 NaHCO3脅迫對植株高生長的影響

從表1可以看出，0.2%、0.4%的NaHCO3處理后，只有TCP7-4株系的高生長高于對照株系，其他3個轉基因株系均低于對照株系；但0.8%的NaHCO3處理后，除TCP7-3株系外，其他各株系的樹高生長量均高于對照株系，最高的是TCP7-4，相對生長量達到244%，TCP7-2次之，相對生長量是167%。

3 結論與討論

目前針對TCP的研究集中于發育調控，在抗逆方面的研究鮮見報道。OsTCP19在調節非生物脅迫中發揮了重要的作用，鹽和干旱條件下水稻中OsTCP19基因的表達量上調了5～6倍，并且在擬南芥中過量表達的OsTCP19引起ABI3、ABI4、IAA3的上調表達和LOX2下調表達，導致植株的發育異常[16]。在水曲柳中，研究FmTCP4對冷、鹽及旱的響應發現，FmTCP4明顯響應了這3種非生物脅迫，并且其響應模式并不相同。NaCl處理后，FmTCP4基因的表達呈現先上調后下調的趨勢，在6 h出現顯著上調，達到峰值，為對照的70.69倍[17]。在水稻中證明了過量表達或抑制OsTCP14(PCF6)和OsTCP21顯著降低或增加植物的冷脆弱性，且OsTCP14(PCF6)和OsTCP21在冷脅迫下負調控ROS介導的逆境脅迫反應[18]。在前期研究中發現，白樺TCP7啟動子中含有鹽、旱及ABA響應元件，通過NaCl及PEG處理后TCP7啟動子表現出一定的響應。本研究對轉TCP7白樺進行不同濃度的NaHCO3脅迫處理，發現低濃度的NaHCO3處理后轉基因及對照株系差別不明顯，但中、高濃度的NaHCO3處理后，對照株系的細胞膜損傷程度明顯高于轉基因株系，而滲透調節物及活性氧清除酶類的積累明顯低于轉基因株系，說明BpTCP7基因提高了白樺的抗鹽堿能力。

綜上所述，轉TCP7白樺株系在NaHCO3脅迫下，能有效誘導體內的保護酶系統，清除體內的活性氧，降低膜脂氧化損傷，一定程度上維持了植物正常的生理代謝活動。同時，通過體內滲透調節物質的積累，起到了滲透調節的作用，使得轉TCP7白樺對NaHCO3等逆境適應性增強。