基于紫外—可見、紅外及物理方法聯(lián)用的參附注射液指紋圖譜方法學(xué)建立

劉 濤，楊 丹，鄭 燕，賀楨翔，張文靜，羅 虹，潘春暉，楊紅玉

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川德成動物保健品有限公司，四川 德陽 618000)

0 引 言

參附注射液主要由紅參、黑附片提取物組成，其有效成分為人參皂苷、烏頭生物堿，主要用于治療元氣大虧、手足厥冷與頭暈氣短等癥[1].參附注射液于1987年上市，并于1992年被國家中醫(yī)藥管理局批準(zhǔn)為醫(yī)院急診必備中成藥[2].據(jù)文獻報道，參附注射液在臨床應(yīng)用過程中，通常會出現(xiàn)輕微不良反應(yīng).根據(jù)《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》規(guī)定，參附注射液評定標(biāo)準(zhǔn)僅局限于薄層鑒別、烏頭類生物堿限量檢查及人參皂苷含量測定等，并沒有對其多個成分的全面評價.研究表明，中藥指紋圖譜可以較充分地反映中藥復(fù)雜混合體系中各種化學(xué)成分量分布的整體狀況，已廣泛應(yīng)用于中藥的質(zhì)量評價中[3-5].其中，紫外—可見指紋圖譜是中藥及其制劑質(zhì)量分析中常用的一種方法，具有靈敏性高、精密度好和操作簡單等優(yōu)點[6]，紅外指紋圖譜中建立的共有峰率和變異峰率兩個獨立指標(biāo)，在二維參數(shù)空間中從相似性和差異性兩個方面可同時對中藥的質(zhì)量進行分析，較一維參數(shù)空間具有更強的分辨能力[7]；物理指紋圖譜可對中藥注射液的質(zhì)量及穩(wěn)定性進行評價[8].故本研究擬采用紫外—可見、紅外、物理指紋圖譜聯(lián)用的方法，以全面、直觀、有效地對參附注射液的質(zhì)量及穩(wěn)定性進行評價.

1 材料與儀器

1.1 材 料

實驗所用材料包括：參附注射液(效期內(nèi)批號，160609、160611、161102、160601、161011、170702、160612、170105；效期外批號，150501、130719、130718)，由四川雅安三九藥業(yè)有限公司提供；溴化鉀(批號，20170526)，購自天津市卒越化學(xué)品有限公司；水為怡寶純凈水.

1.2 儀 器

實驗所用儀器包括：Spectrum-II型紅外光譜儀(Pekin Elmer公司)；PHS-3C型精密pH計、DDS-307型電導(dǎo)率儀(上海日島科學(xué)儀器有限公司)；E-201-C pH型復(fù)合電極(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)；101-1-S型電熱鼓風(fēng)干燥箱(成都雅源科技有限公司)；TU-1810PC型紫外—可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；SMC-30C型滲透壓摩爾濃度測定儀(天津天河醫(yī)療儀器有限公司)；WAY-2S型數(shù)字阿貝折射儀(上海申光儀器儀表有限公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 紫外—可見指紋圖譜

2.1.1 供試品溶液的制備.

精密量取2.00 mL參附注射液(批號，160612)于50 mL量瓶中，加純凈水至刻度，搖勻，制得供試品溶液.

2.1.2 光譜掃描條件.

用水作為空白對照，在波長200～800 nm下，以光譜帶寬2.00 nm，光度模式為Abs，掃描間隔為1.0 nm，進行全波長掃描.

2.1.3 方法學(xué)考察.

按“2.1.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項所確定的光譜掃描條件進行掃描，得到圖譜后，用樣品的吸收波長對應(yīng)的吸光度計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD.測得精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性考察項下紫外—可見圖譜在297 nm、269 nm、243 nm波長處吸光度的RSD均小于5.0%.結(jié)果表明，方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求.

2.1.4 樣品圖譜的采集及對照圖譜的建立.

取8批參附注射液，按“2.1.1”項下所確定的方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項所確定的光譜掃描條件進行掃描，得到8批參附注射液的紫外—可見疊加圖譜，結(jié)果見圖1，并取其吸光度的平均值得到對照紫外—可見指紋圖譜，結(jié)果見圖2.

圖1 8批參附注射液紫外—可見光譜疊加圖

2.1.5 吸光度值限度.

8批有效期內(nèi)的參附注射液的紫外—可見圖譜于297 nm、269 nm、243 nm波長下的吸光度值結(jié)果見表1.

由表1可知，有效期內(nèi)的參附注射液，按照“2.1.1”項所確定的方法制備供試品溶液，按“2.1.2"項所確定的光譜掃描條件掃描，所得紫外—可見圖譜吸光度值應(yīng)同時分別滿足297 nm(0.330～0.460)、269 nm(0.587～0.734)、243 nm(0.520～0.630).

圖2 參附注射液對照紫外—可見指紋圖譜

2.1.6 驗證實驗.

按照“2.1.1”項所確定的方法制備供試品溶液，按“2.1.2”項所確定的光譜掃描條件掃描.結(jié)果表明，3批效期外參附注射液樣品中，其吸光度值不符合限度要求.

2.2 紅外指紋圖譜

2.2.1 測試條件.

精密吸取參附注射液50 μL于瑪瑙研缽中，揮干，加入0.1 g溴化鉀，研磨均勻后，壓片，在紅外光譜儀中測定，測定區(qū)域為4 000～450 cm-1.

2.2.2 方法學(xué)考察.

按照“2.2.1”項下的測試條件進行測定，計算圖譜中4個特征吸收波數(shù)處透光率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD.經(jīng)考察，測得精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性項下4個特征吸收波數(shù)所對應(yīng)透光率RSD均小于5.0%.結(jié)果表明，方法的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性均符合要求.

2.2.3 不同批次參附注射液紅外指紋圖譜的采集.

11批不同批次參附注射液的紅外指紋圖譜如圖3所示.

2.2.4 紅外指紋圖譜共有峰和變異峰的確定.

在紅外指紋圖譜中，對于不同圖譜的共有峰可以采用正態(tài)分布進行檢驗.通過檢驗后，若組內(nèi)吸收峰的波數(shù)最大差異顯著小于其相鄰組之間的平均波數(shù)差，可將其確定為是一組共有峰，相反則為變異峰.共性識別指標(biāo)為:共有峰率，P=(Ng/Nd)×100%；變異峰率，Pva=(na/Ng)×100%；Pvb=(nb/Ng)×100%，Nd=Ng+na+nb.其中Pva、Pvb、Ng、Nd、na、nb分別為a圖譜的變異峰率、b圖譜的變異峰率、2圖譜中共有峰數(shù)、獨立峰數(shù)、a圖譜的變異峰數(shù)、b圖譜的變異峰數(shù).

圖3 11批參附注射液紅外光譜疊加圖

2.2.5 指紋圖譜共有峰識別及雙指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)建立.

根據(jù)紅外指紋圖譜測定數(shù)據(jù)，以各樣品為參考，利用紅外指紋圖譜變異峰率及共有峰率計算公式計算出樣品之間的變異峰率及共有峰率，按照不同批次參附注射液共有峰率大小排成n維序列片段，該系列稱為共有峰率和變異峰率的雙指標(biāo)序列.通過該雙指標(biāo)序列可以衡量不同批次樣品之間相似度，選取效期內(nèi)的8批參附注射液，建立共有峰率及變異峰率標(biāo)準(zhǔn)范圍，結(jié)果如表2所示.

由表2可知，參附注射液的共有峰率為54.83%～91.67%，變異峰率為0.00%～52.94%.

2.2.6 驗證實驗.

取3批效期外參附注射液，根據(jù)紅外指紋圖譜測定數(shù)據(jù)，以各樣品為參考，利用紅外指紋圖譜變異峰率及共有峰率計算公式計算出樣品之間的變異峰率及共有峰率，按照不同批次參附注射液共有峰率大小排成n維序列片段.結(jié)果表明，效期外3批參附注射液共有峰率最低為51.72%，變異峰率最高為53.33%，其中，1批不符合限度要求，其余2批均符合限度要求.

2.3 物理指紋圖譜

2.3.1 物理質(zhì)量指標(biāo)的測定方法.

參附注射液物理指紋圖譜中參數(shù)的測定首選法定標(biāo)準(zhǔn)收載方法[8-9]，其相關(guān)指標(biāo)包括：氫離子濃度指數(shù)(pH)、電導(dǎo)率(G)、相對密度(d)、運動黏度(v)、固含物(M)、濁度(T)、滲透壓摩爾濃度(O)、折光率(n).

表2 8批參附注射液紅外指紋圖譜共有峰及變異峰率/%

2.3.2 物理質(zhì)量指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換.

由于用于構(gòu)建物理指紋圖譜的8個物理參數(shù)的數(shù)值和量綱不同，為了方便定量直觀地利用雷達圖進行展示，參考藥典標(biāo)準(zhǔn)和物理化學(xué)參數(shù)手冊，確定每個指標(biāo)的可能數(shù)值范圍，然后將其標(biāo)準(zhǔn)化至同一尺度，即0～10.參附注射液物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換見表3.

表3 參附注射液物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)

2.3.3 參附注射液對照物理指紋圖譜的構(gòu)建.

8批效期內(nèi)參附注射液，按照“2.3.1”項下確定的方法測定供試品各物理參數(shù)，并對其數(shù)值進行標(biāo)準(zhǔn)化,結(jié)果見表4,并以8批參附注射液各個標(biāo)準(zhǔn)化物理參數(shù)的平均值作雷達圖，即得到對照物理指紋圖譜,結(jié)果見圖4.

表4 參附注射液物理參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)換

圖4參附注射液對照物理指紋圖譜

2.3.4 物理參數(shù)限度要求.

8批效期內(nèi)參附注射液的8 個物理參數(shù)值及標(biāo)準(zhǔn)化值的范圍如表3所示.這8批效期內(nèi)的參附注射液，按照“2.3.1”項所確定的方法測定供試品，所得物理指紋譜，可用于評價其他批次參附注射液的各個指標(biāo)是否同時滿足表4中的標(biāo)準(zhǔn)化范圍.

2.3.5 驗證實驗.

按照“2.3.1"項所確定的方法測定3批效期外樣品，所得物理指紋圖譜8個參數(shù)值.結(jié)果表明，3批效期外參附注射液樣品的物理指紋圖譜8個物理參數(shù)值基本不在標(biāo)準(zhǔn)化值范圍內(nèi)，因此不符合標(biāo)準(zhǔn).

3 討 論

目前，參附注射液由雅安三九藥業(yè)有限公司獨家生產(chǎn)，因此不能比較不同廠家的質(zhì)量差異，此外在建立其指紋圖譜時，8批參附注射液中生產(chǎn)批次時間相近.其中，紫外—可見指紋圖譜，其吸光度值可以規(guī)定其范圍，紅外指紋圖譜中發(fā)現(xiàn)共有峰率最低可達54.83%，最高可達91.67%，變異峰率最高為52.94%，物理指紋圖譜中標(biāo)準(zhǔn)范圍較廣.研究表明，參附注射液即使由同一個廠家生產(chǎn)且生產(chǎn)批次相近，也可能存在質(zhì)量上的差異，其原因可能是參附注射液中的某一成分不穩(wěn)定而造成的，具體成分還有待進一步驗證.

在本研究的指紋圖譜方法學(xué)建立采用的是8批效期內(nèi)參附注射液，而批次數(shù)量也能從一定程度上反應(yīng)樣品的整體情況.3批效期外參附注射液的驗證發(fā)現(xiàn)，紫外—可見指紋圖譜吸光度值均不符合要求，紅外指紋圖譜中有1批樣品的共有峰率與變異峰率超出其允許范圍，物理指紋圖譜中3批樣品均不符合要求.由此可見，紫外—可見、紅外、物理指紋圖譜均能全面地反應(yīng)過期與非過期樣品的質(zhì)量差異.

本研究將紫外—可見、紅外、物理指紋圖譜運用到參附注射液質(zhì)量評價中，初步確定了其標(biāo)準(zhǔn)范圍，以從整體上控制參附注射液質(zhì)量，改變了以單一化學(xué)成分的定性及定量控制產(chǎn)品質(zhì)量模式，提升了參附注射液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn).研究結(jié)果也表明，紫外—可見、紅外、物理指紋圖譜法聯(lián)用的方法對液體藥物質(zhì)量評價具有一定的研究意義.