基于溶血率的金銀花與山銀花質(zhì)量差異研究

徐玉玲, 鄭 燕，葉 萌, 梁 鑫,王 晨，潘春暉，楊紅玉

(1.成都大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106；2.四川德成動(dòng)物保健品有限公司，四川 德陽(yáng) 618000)

0 引 言

金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花.“金銀花”一名，始載于宋代方書(shū)《蘇沈良方》，至明代《本草綱目》，除藤葉藥用以外，開(kāi)始強(qiáng)調(diào)以花入藥[1].藥理研究表明，金銀花具有抑菌、抗病毒、解熱及降血脂等作用[2].山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1].山銀花具多種藥理作用，具有抑菌殺菌、抗病毒、抗炎、抗過(guò)敏和肝臟保護(hù)等作用[3].楊倩茹等[4]對(duì)金銀花與山銀花化學(xué)成分進(jìn)行研究表明，金銀花較山銀花含有較豐富的環(huán)烯醚萜類(lèi)和黃酮類(lèi)化合物，而山銀花中三萜皂苷類(lèi)化合物種類(lèi)較多.目前，金銀花是中藥注射劑中的常用組分，如清開(kāi)靈注射液、熱毒寧注射液、注射用雙黃連凍干粉等[5].據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，皂苷類(lèi)成分一般具有溶血作用，當(dāng)其制備成注射劑時(shí)，需考慮其溶血風(fēng)險(xiǎn)[6-9].對(duì)此，本實(shí)驗(yàn)對(duì)比分析了金銀花藥材與山銀花藥材的體外溶血作用，擬對(duì)二者的內(nèi)在質(zhì)量進(jìn)行分析評(píng)價(jià).

1 材料與儀器

1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)所用材料包括：金銀花、山銀花藥材購(gòu)置于不同藥店，經(jīng)成都大學(xué)劉濤研究員鑒定，山銀花藥材品種為灰氈毛忍冬，金銀花與山銀花藥材來(lái)源分別見(jiàn)表1、表2；0.9% NaCl注射液(批號(hào)，B15042001)，購(gòu)自四川科倫藥業(yè)股份有限公司；水為藍(lán)光純凈水，其余試劑均為分析純；新西蘭大白兔(合格證號(hào)，SCXK(川)2013-17)，購(gòu)自成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司.

表1 金銀花來(lái)源

表2 山銀花來(lái)源

1.2 儀 器

實(shí)驗(yàn)所用儀器包括：TU-1810PC型紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司)；BS-6KH型電子分析天平(上海友聲衡器有限公司)；HS-3120型超聲清洗器(天津恒奧科技發(fā)展有限公司)；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州國(guó)華電器有限公司)；TD5型離心機(jī)(長(zhǎng)沙英泰儀器有限公司).

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取金銀花粉末1 g，精密稱(chēng)定，置具塞錐形瓶中，加入70% 甲醇溶液100 mL，稱(chēng)重，超聲處理20 min，稱(chēng)其質(zhì)量，用70% 甲醇溶液補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò).取續(xù)濾液50 mL于蒸發(fā)皿(多次加入)，于70 ℃水浴蒸干，加入40 μL二甲基亞砜，超聲助溶，再加入生理鹽水進(jìn)行稀釋?zhuān)瑢⒃撊芤褐糜?00 mL量瓶中，定容，得金銀花樣品儲(chǔ)備液.取儲(chǔ)備液適量，加生理鹽水分別稀釋成含金銀花質(zhì)量濃度為0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L的供試品溶液[5].同時(shí)，采用相同方法制備山銀花樣品的供試品溶液.

2.2 紅細(xì)胞混懸液的制備

從實(shí)驗(yàn)家兔耳緣靜脈取新鮮血液20 mL，置燒杯中，用纏有少量脫脂棉的玻璃棒輕輕攪拌10 min，取出血液中的纖維蛋白，制成脫纖血液，加入約10 倍量生理鹽水，搖勻，于3 000 r/min離心10 min，棄去上清液.按此方法重復(fù)4～5次，洗至上清液呈無(wú)色透明，將所得紅細(xì)胞用生理鹽水配制成壓積為2% 的紅細(xì)胞混懸液，置于4 ℃冰箱中保存，備用[10].

2.3 溶血率的測(cè)定

溶血率采用紫外—可見(jiàn)分光光度法進(jìn)行測(cè)定，具體步驟為：

以3 mL生理鹽水中加入兔紅細(xì)胞混懸液 3 mL為陰性組；以3 mL水中加入兔紅細(xì)胞混懸液3 mL為陽(yáng)性組(滲透壓的改變?cè)斐杉t細(xì)胞完全溶血)；以按“2.1”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備的不同質(zhì)量濃度的金銀花供試品溶液與山銀花供試品溶液各3 mL分別加入兔紅細(xì)胞混懸液3 mL作為樣品組.將各組溶液輕輕振搖，混合均勻，置(37±0.5)℃恒溫培養(yǎng)箱中保溫3 h，保溫完畢取出，于2 000 r/min離心10 min，吸取上清夜至比色皿中.以陰性組為空白，采用比色法于540 nm波長(zhǎng)下分別測(cè)定陽(yáng)性組的吸光度(A陽(yáng))和樣品組的吸光度(A樣).由于金銀花與山銀花供試品溶液具有吸光度，因此加入兔血后測(cè)出的吸光度需減去金銀花與山銀花供試品溶液的吸光度(A空).并按照溶血率=(A樣-A空)/A陽(yáng)×100%，計(jì)算溶血率.

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3批金銀花樣品與3批山銀花樣品不同質(zhì)量濃度下的溶血率見(jiàn)表3、表4.

表3 金銀花樣品不同質(zhì)量濃度下溶血率

表4 山銀花樣品不同質(zhì)量濃度下溶血率

3 結(jié)果分析

3.1 相似度分析

將3批金銀花樣品作為一組標(biāo)準(zhǔn)樣品，利用數(shù)據(jù)處理軟件“IBM SPSS statistics"中雙變量相關(guān)“Kendall的tau-b"依次對(duì)3批山銀花樣品進(jìn)行相似度分析，并進(jìn)行相似度測(cè)算，結(jié)果見(jiàn)表5.

表5 金銀花與山銀花樣品相似度分析表

由表5可知，金銀花樣品與山銀花樣品溶血率相似度最高為73.3%，最低為27.6%.此表明，金銀花樣品的內(nèi)在質(zhì)量與山銀花樣品的內(nèi)在質(zhì)量存在差異.

3.2 溶血率—質(zhì)量濃度曲線分析

將3批金銀花藥材及3批山銀花藥材在不同質(zhì)量濃度下的溶血率計(jì)算平均值，建立溶血率—質(zhì)量濃度曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1.

由圖1(H1)可見(jiàn)，當(dāng)金銀花樣品溶液質(zhì)量濃度≤1.0 g/L時(shí)，不存在體外紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象；在質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)溶血率急劇增大；在質(zhì)量濃度為4.0 g/L時(shí)，溶血作用基本達(dá)到最大；在質(zhì)量濃度為5.0 g/L時(shí)溶血率基本達(dá)到平衡.

由圖1(H2)可見(jiàn)，當(dāng)山銀花樣品溶液質(zhì)量濃度≤1.0 g/L時(shí)，不存在體外紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象；在質(zhì)量濃度為2.0 g/L時(shí)溶血率急劇增大，在質(zhì)量濃度為3.0 g/L時(shí)，溶血作用基本達(dá)到最大，在質(zhì)量濃度為4.0 g/L時(shí)溶血率基本達(dá)到平衡.

圖1金銀花、山銀花樣品溶血率—質(zhì)量濃度曲線

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，金銀花樣品的最大溶血率小于山銀花樣品，且達(dá)到最大溶血率的質(zhì)量濃度較山銀花大，說(shuō)明金銀花樣品與山銀花樣品內(nèi)在質(zhì)量存在差異，其原因是金銀花樣品含皂苷類(lèi)化合物較山銀花少.

3.3 “Smirnov”分析

根據(jù)判定“可疑值"能否舍棄的“Smirnov"法，以3批金銀花不同質(zhì)量濃度下溶血率為一組，判定每一批山銀花樣品的相似度Ti是否為可疑值，如為可疑值，應(yīng)該舍棄不用.

Ti=|(Xi-X)|/S

式中，Xi為可疑值，X為包括可疑值在內(nèi)的平均數(shù)，S為標(biāo)準(zhǔn)差[11].

查詢(xún)“Smirnov”法附表，n=4時(shí)，Ti>1.689，表明有顯著性差異.不同質(zhì)量濃度下樣品的Ti值見(jiàn)表6.

表6 金銀花樣品與山銀花樣品可疑值分析表

由表6可知，r2的Ti(1 g/L)與Ti(5 g/L)的Ti值>1.689，r3的Ti(2 g/L)的Ti值>1.689，其余值均<1.689，表明山銀花樣品中r2的Ti(1 g/L)、Ti(5 g/L)與r3的Ti(2 g/L)為可疑值，應(yīng)舍去，即山銀花樣品r2、r3與3批金銀花樣品比較，具有顯著性差異.

3批山銀花藥材樣品中，有2批樣品與金銀花樣品存在顯著性差異，表明金銀花藥材與山銀花藥材溶血作用存在顯著性差異.

4 討 論

黃娜等[5]研究表明，金銀花藥材與山銀花藥材具有體外溶血作用，作為注射劑時(shí)，具有潛在溶血風(fēng)險(xiǎn)，溶血作用的產(chǎn)生源于二者皂苷的含量，本研究基于金銀花藥材與山銀花藥材存在體外溶血的作用，采用紫外—可見(jiàn)分光光度計(jì)法對(duì)二者溶血作用進(jìn)行分析，通過(guò)二者溶血作用差異，進(jìn)一步說(shuō)明二者的皂苷種類(lèi)與含量存在差異，繼而說(shuō)明金銀花藥材與山銀花藥材內(nèi)在質(zhì)量存在差異.現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)二者進(jìn)行質(zhì)量分析時(shí)，均對(duì)二者主要成分及含量進(jìn)行分析，缺少對(duì)各成分間相互作用的研究，本實(shí)驗(yàn)基于二者藥效作用分析，進(jìn)一步表明二者存在差異.

本研究采用“IBM SPSS Statistics”軟件分析了金銀花標(biāo)準(zhǔn)樣品組與山銀花各批次之間差異，表明二者相似度較低；采用溶血率—質(zhì)量濃度曲線分析，金銀花樣品出現(xiàn)溶血率最大值時(shí)質(zhì)量濃度較山銀花樣品大，表明金銀花樣品皂苷含量較山銀花樣品少；采用“Smirnov"分析，表明山銀花樣品與金銀花樣品存在顯著性差異.3種分析方式的聯(lián)用，均表明二者質(zhì)量間存在差異.

研究發(fā)現(xiàn)，不同批次金銀花樣品間相同質(zhì)量濃度下溶血率相差較大，質(zhì)量濃度為3 g/L時(shí)，RSD為80.29%；不同批次山銀花樣品間相同質(zhì)量濃度下溶血率相差也較大，質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)，RSD為130.95%.此表明金銀花樣品與山銀花樣品間差異可能來(lái)源于藥材本身，且本實(shí)驗(yàn)僅基于品種為灰氈毛忍冬的山銀花藥材的研究，不能說(shuō)明金銀花藥材與山銀花藥材內(nèi)在質(zhì)量存在較大差異.此表明，在分析藥材間質(zhì)量時(shí)，需對(duì)藥材本身質(zhì)量進(jìn)行探討，而現(xiàn)有文獻(xiàn)缺乏該方面討論.

此外，金銀花藥材與山銀花藥材質(zhì)量濃度為2 g/L時(shí)已出現(xiàn)體外溶血.體外溶血率與甲醇濃度、超聲時(shí)間、二甲基亞砜用量及樣品保溫時(shí)間存在較大聯(lián)系，當(dāng)上述條件發(fā)生變化時(shí)，會(huì)出現(xiàn)溶血率降低甚至不出現(xiàn)溶血的狀況.楊光[12]研究表明，皂苷可以同血紅細(xì)胞壁上的膽甾醇結(jié)合生成不溶性分子復(fù)合物沉淀，造成血紅細(xì)胞正常滲透性被破壞而發(fā)生崩解，進(jìn)而產(chǎn)生溶血作用.本實(shí)驗(yàn)樣品制備方式極大程度提取了皂苷，從而發(fā)生了體外溶血作用.

本研究采用體外溶血作用對(duì)金銀花藥材與山銀花藥材內(nèi)在質(zhì)量的分析克服了現(xiàn)有文獻(xiàn)對(duì)主要成分分析的不完整性，也進(jìn)一步說(shuō)明了中藥作用的多成分、不確定性，實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果為中藥內(nèi)在質(zhì)量差異研究提供了一種新的思路.