青霉素類(lèi)抗生素廣譜性酶聯(lián)免疫分析方法的建立

劉偉怡，劉鳳銀，江海超，王宇，劉佳，鄒紅麗，穆洪濤*

（1.廣東第二師范學(xué)院生物與食品工程學(xué)院廣東廣州 5103032; 2.廣州市食品檢驗(yàn)所廣東廣州 511400）

青霉素類(lèi)抗生素藥物屬于窄譜殺菌性抗生素，可通過(guò)抑制革蘭氏陽(yáng)性菌胞壁的形成，使細(xì)菌胞壁破損、胞內(nèi)滲透壓下降，菌體漲裂而死亡，從而起到殺菌作用，具有高效、低毒的特點(diǎn)[1]。非治療目的用藥、執(zhí)行休藥期規(guī)定不嚴(yán)格、非法人為摻雜、飼養(yǎng)管理不當(dāng)、抗生素濫用等都會(huì)導(dǎo)致青霉素類(lèi)抗生素在畜產(chǎn)品中殘留[2]。青霉素類(lèi)抗生素殘留不僅可能會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生耐藥菌株[3]，免疫抑制、體內(nèi)蓄積、破壞人體微生態(tài)平衡、破壞環(huán)境，而且可能會(huì)引發(fā)過(guò)敏反應(yīng)，其引起的過(guò)敏性休克，可嚴(yán)重影響人體健康安全[4]。

目前，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的青霉素類(lèi)抗生素殘留檢測(cè)方法主要有微生物檢測(cè)法（MIT)[5]、高效液相色譜法（HPLC）[6]、熒光免疫測(cè)定法[7]、青霉素生物傳感器檢測(cè)[8]、光譜法[9]等。微生物測(cè)定法前處理簡(jiǎn)單、成本低，但其易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果；免疫分析法簡(jiǎn)便快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)，但程序復(fù)雜且易受到其他因素影響；理化分析法具有高靈敏度和高精確度，但對(duì)操作人員和儀器要求較高。

青霉素酶聯(lián)免疫檢測(cè)方法一般采用多克隆抗體的方法，其特異性不夠強(qiáng)，篩選工作量大，即使運(yùn)用了標(biāo)記的方法，也會(huì)造成不易區(qū)分、工作繁重等問(wèn)題。并且免疫法現(xiàn)存的問(wèn)題（廣譜性不夠高），其試劑盒只能單獨(dú)檢測(cè)某一種抗生素殘留，在實(shí)際應(yīng)用是多種抗生素聯(lián)用，需要用上多種試劑盒[10]。本研究通過(guò)制備獲得廣譜性識(shí)別青霉素類(lèi)抗生素的抗體，建立針對(duì)牛奶中青霉素類(lèi)抗生素殘留的廣譜性酶聯(lián)免疫分析方法。通過(guò)此種方法可以一次性篩查全部青霉素類(lèi)抗生素，從而為青霉素類(lèi)抗生素的監(jiān)控和管理提供有力的檢測(cè)方法。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

重2 kg左右的健康雌性新西蘭大白兔，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑與材料

青霉素類(lèi)抗生素、牛血清白蛋白、卵清蛋白、N-羥基琥珀酰亞胺、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、其他化學(xué)試劑均為分析純；均購(gòu)于廣州市齊云生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。酶標(biāo)板購(gòu)于廈門(mén)怡佳美實(shí)驗(yàn)器材有限公司。

1.3 主要儀器

SP-Max2300A光吸收型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）、全自動(dòng)洗板機(jī)（深圳雷社生命科學(xué)股份有限公司）、電子天平（上海越平科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）、UV755B紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海佑科儀器儀表有限公司）。

2 方法

2.1 人工抗原的制備及鑒定

采用活潑酯法將青霉素G制備人工抗原PENBSA、PEN-OVA，并通過(guò)紫外光譜確證偶聯(lián)是否成功。

2.2 PEN多克隆抗體的制備

將免疫原PEN-OVA對(duì)新西蘭大白兔進(jìn)行免疫，采用背部皮下多點(diǎn)注射，第六次免疫4～6天后心臟采血收集全部血清，分離血清后加上具有防腐作用的0.02%NaN3，用間接ELISA方法測(cè)定血清效價(jià)。

2.3 間接ELISA方法的建立

用已確定的抗原包被濃度稀釋抗原，1 μg/mL包被酶標(biāo)板，100 μL/孔，37 ℃孵育過(guò)夜，洗板兩次，加入封閉液120 μL/孔，37 ℃孵育3小時(shí)，甩干，37 ℃烘干1h；每孔加陽(yáng)性血清100 μL，37 ℃孵育40 min，洗板5次；加入HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100 μL/孔，37 ℃孵育40 min，洗板5次；加入顯色液100 μL/孔，37 ℃孵育10 min，最后加入50 μL 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，測(cè)定A450。

3 結(jié)果與討論

3.1 偶聯(lián)產(chǎn)物鑒定

紫外分光光度法是利用物質(zhì)對(duì)光的吸收與其濃度呈比例關(guān)系的原理分別測(cè)定被偶聯(lián)的兩種分子濃度，結(jié)果見(jiàn)圖1，兩種分子PEN-BSA、PEN-OVA均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現(xiàn)出光譜圖迭加的性質(zhì)，初步鑒定人工抗原偶聯(lián)成功。

3.2 新西蘭大白兔血清效價(jià)的測(cè)定

抗體效價(jià)是評(píng)價(jià)抗體性能的一個(gè)重要指標(biāo)，通過(guò)間接ELISA法測(cè)定兩只兔抗血清效價(jià)都高達(dá)10-5，說(shuō)明抗體在很低的濃度范圍內(nèi)，仍能與抗原反應(yīng)，二者之間有很強(qiáng)的結(jié)合力。此外，免疫分析中使用高效價(jià)的抗體可提高檢測(cè)的靈敏度。

3.3 同源與異源ELISA方法的選擇

首先活潑酯法分別將半抗原（氯唑西林鈉（CLO）、苯唑西林鈉（OXA）、羧芐西林鈉（CAR）、磺芐西林鈉（SUL）、青霉素V（PENV）、氨芐西林（AMP）、阿莫西林（AMO）、6-氨基青霉烷酸（6-APA）與OVA偶聯(lián)成8種包被原，經(jīng)紫外掃描鑒定包被原偶聯(lián)成功。采用間接ELISA法，進(jìn)行青霉素類(lèi)抗生素異源包被選擇，以提高靈敏度。由圖2結(jié)果可知，以CAR-OVA為異源包被原檢測(cè)最高效價(jià)為9000，PENV-OVA作為包被原時(shí)效價(jià)為4000；且CAROVA的抑制率高于其他異源包被原，因此，選擇羧芐青霉素鈉與OVA偶聯(lián)而成的人工抗原（CAR-OVA）作為異源包被原。

圖1 PEN-BSA、PEN-OVA偶聯(lián)物組合圖

圖2 同源與異源血清效價(jià)檢測(cè)曲線

3.4 包被抗原和抗體最佳工作濃度試驗(yàn)結(jié)果

選取同源PEN-OVA，異源CAR-OVA作為包被原，采用間接ELISA方法、方陣滴定法確定抗原和抗體最佳的工作濃度。根據(jù)表1結(jié)果，當(dāng)選擇CAROVA作為包被原時(shí)方法的靈敏度最高，其IC50最小，因此選用異源包被原CAR-OVA的最佳工作濃度1 μg/mL，2號(hào)兔抗血清最佳稀釋倍數(shù)為1∶8000。

3.5 ELISA方法的優(yōu)化

采取控制單因素條件的方法，逐步優(yōu)化各個(gè)條件，按照間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的程序，以CAR-OVA最佳工作濃度包被，對(duì)比不同條件下的Amax和IC50，綜合考慮IC50/Amax值較小且曲線擬合度較好。由表2結(jié)果可知，實(shí)驗(yàn)選擇37 ℃過(guò)夜包被、封板30 min、競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)和二抗反應(yīng)40 min、顯色反應(yīng)10 min，其IC50、IC50/Amax值最小。

表1 在不同包被原和抗體最佳濃度下的IC50

表2 ELISA方法的優(yōu)化

3.6 特異性的測(cè)定

結(jié)構(gòu)類(lèi)似的青霉素類(lèi)藥物引起的交叉反應(yīng)大小可以用來(lái)表示抗體的特異性，也可以描述分析方法的特異性。間接ELISA法測(cè)定交叉反應(yīng)結(jié)果見(jiàn)表3。以PEN多克隆抗體與PEN特異反應(yīng)率為100%，抗體與青霉素V特異反應(yīng)率為0.1%，其他8種青霉素類(lèi)藥物與之交叉反應(yīng)率很低，結(jié)果表明本研究制備的PEN多克隆抗體是高特異性的。

這主要是由于多克隆抗體識(shí)別青霉素G的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，青霉素G和青霉素V側(cè)鏈結(jié)構(gòu)相似，青霉素G的側(cè)鏈基團(tuán)為苯乙酰氨基，青霉素V的側(cè)鏈基團(tuán)為苯氧乙酰氨基，而其他青霉素類(lèi)抗生素的結(jié)構(gòu)與青霉素G存在較大的差異，抗體不能識(shí)別，因此交叉反應(yīng)率低。

表3 PEN多克隆抗體與其他青霉素類(lèi)藥物的交叉反應(yīng)

3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

所有優(yōu)化條件確定后，將青霉素G標(biāo)準(zhǔn)品配成濃度為0 ，0.064，0.32，8，40，200，1000 μg/mL系列濃度，用ELISA法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖3，計(jì)算曲線的線性回歸方程為y=-0.2025x+0.7625，相關(guān)系數(shù)0.9691，其中線性范圍介于0.064～200μg/mL，抑制率為50 %時(shí)，最低可檢測(cè)濃度為2.22 μg/mL，檢測(cè)限為0.14 μg/mL。

圖3 青霉素G的間接ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.8 準(zhǔn)確性的測(cè)定（添加回收率）

在早餐奶、舒化奶、高鈣奶和純牛奶中添加PEN標(biāo)準(zhǔn)溶液（1、10、100 μg/mL），每份樣品的提取液做3個(gè)平行重復(fù)。其回收率和變異系數(shù)測(cè)定結(jié)果如表4。四種牛奶中，樣品回收率范圍在74.0%～106.3%，變異系數(shù)小于0.21%，達(dá)到獸藥殘留分析要求。

表4 PEN回收率的測(cè)定（n=3）

4 結(jié)論

本文利用青霉素G所獲得的PEN多克隆抗體，效價(jià)高于1：105，與其他8種青霉素類(lèi)藥物交叉反應(yīng)很低。通過(guò)優(yōu)化一系列條件，CAR-OVA為最佳的異源包被原以提高靈敏度，建立了PEN標(biāo)準(zhǔn)曲線，最低可檢測(cè)濃度為2.22 μg/mL，檢測(cè)限為0.14 μg/mL。添加回收率的范圍為74.0%～106.3%，變異系數(shù)小于0.21%。綜上所述，獲得的青霉素G多克隆抗體特異性強(qiáng)、親和力高，為青霉素G多組分殘留快速免疫分析奠定理論基礎(chǔ)。