微生物檢測中ATP生物發光法的應用研究現狀

易琳

（西華師范大學生命科學學院，四川南充 637000）

人類的身體健康、生命安全長期受到微生物污染的威脅，營養瓊脂平板計數法是國際上針對微生物檢測的現有標準方法，然而該方法要求在37 ℃下持續培養48 h，過于繁瑣的操作無法實現快速檢測。現下，國內也加大了對核酸法、電阻抗測量、免疫學方法、微菌落技術等各類微生物快速檢測技術展開了研究、應用。ATP生物發光法因快速、簡便且具有較高靈敏度的緣故，可用于實時監控微生物污染，與食品行業需求相符合，故而有關該技術的研究與應用十分廣泛。

1 食品檢驗中現代生物技術應用的重要性

品質較高的食品安全檢驗能為食品提供一定的安全性保障。我國近年來逐漸加大了有關食品安全問題的重視程度，在現代生物理論的運用下，促使現代生物技術獲得了更為廣泛的運用領域[1]。同時，近年來生物技術的快速發展，使其得以在實現精確測試檢驗的基礎上，也具備了安全、環保等特點，十分適用于食品安全檢驗。傳統生物及食品檢驗技術難以為食品提供可靠的安全性保障，這也進一步凸顯了現代生物技術的發展前景。鑒于此，本文深入探究了ATP生物發光法在微生物檢測中的運用。

2 ATP生物發光技術檢測微生物的原理及一般步驟

ATP生物發光技術是在Mg2+和熒光素酶E的作用下，ATP與熒光素LH2產生腺苷酰化被活化，而熒光素在被活化后結合熒光素酶會有熒光素—AMP復合體形成，且會有焦磷酸（PPi）產生。當分子氧將復合體氧化后，會有激發態復合物P*-AMP形成，并有CO2產生。而該復合物由激發態朝著基態轉化期間會有光射出，最終會有氧化沖熒光素P和AMP形成。具體反應過程如下：

就ATP生物發光技術而言，其檢測步驟通常為：首先對ATP生物發光值及樣品微生物含量標準曲線進行繪制，隨后在取樣、ATP提取、酶反應試劑添加、樣品微生物ATP發光值測定完成之后，以標準曲線為根據對樣品中微生物實際數值進行測定。

3 ATP生物發光法的優缺點

ATP生物發光法主要包含簡便、快速及較好重現性等優點。但是，因其對樣品提出了至少1 000個/mL細菌濃度的要求，故而無法將衛生學提出的有關靈敏度的要求有效滿足。同時也有ATP生物發光法無法對微生物及非微生物的ATP進行區分等缺點[2]。ATP生物發光法優缺點及應用范圍見表1、表2。

表1 ATP生物發光法優缺點

表2 ATP生物發光法應用范圍

4 ATP生物發光技術在食品微生物檢測中的應用——以酸奶Fe3O4檢測為例

4.1 試驗方法

化學發光檢測：取出1.0μ mol的氨基改性Fe3O4納米粒子，采用吡啶緩沖液反復清洗后，添加200 μL戊二醛溶液并置于室溫環境下持續3h振蕩。加入ATP適體10 pmol，置于室溫環境下持續振蕩1 h。采用WB清洗液反復清洗后，在其內加入2% BSA溶液200μL，置于室溫環境下持續振蕩1 h。再次采用WB清洗液反復清洗后，將Fe3O4納米粒子移入100 μL ATP中（濃度為2 μmol/L、4 μmol/L、6 μmol/L、6 μmol/L、10 μmol/L、12 μmol/L），置于室溫環境下持續振蕩1 h[3]。再次采用WB清洗液反復清洗后磁性分離，借助超純水將Fe3O4納米粒子朝著一端開口的圓柱形玻璃瓶內轉移，并置于BPCL微弱發光儀中，加入90 μL熒光素酶緩沖液，對其熒光發光強度進行測量，最終信號值以最高信號值出現后10 s的積分值為主。

借助化學發光法檢測ATP特異性并開展干擾性實驗：取出1.0 μmol的氨基改性Fe3O4納米粒子，采用吡啶緩沖液反復清洗后，添加200 μL戊二醛溶液并置于室溫環境下持續3h振蕩。加入10 pmol ATP適體在室溫環境下持續振蕩1h。采用WB清洗液反復清洗后，在其內加入200μL 2% BSA溶液，置于室溫環境下持續振蕩1h。借助WB清洗液再次清洗后，在CTP溶液（100μL）、UTP溶液（100μL）、GTP溶液（100μL）、ATP和CTP混合液、ATP和GTP混合液、空白AA緩沖液中加入ATP溶液（10μmol/L），置于室溫環節下持續1h振蕩[4]。采用WB清洗液反復清洗后磁性分離。借助超純水將Fe3O4納米粒子朝著一端開口的圓柱形玻璃瓶內轉移，并置于BPCL微弱發光儀中，加入90μL熒光素酶緩沖液，對其熒光強度進行測量。

4.2 結果

依據上述檢測結果完成曲線圖的繪制。根據圖1能發現，R2=0.996 3時，具有良好的線性范圍，在ATP定量檢測中十分適用。在CTP、GTP、UTP溶液中，表現出較低熒光強度；而在ATP、CTP、GTP、UTP混合溶液中，熒光強度所受到的影響并不大，實驗具有較高可行性。

圖1 化學發光檢測ATP工作曲線

在測定酸奶中ATP時，將乳酸菌中ATP提取后，以Fe3O4納米粒子作為實驗對象，依據化學發光法對其發光值檢測，依據特性完成ATP捕獲[5]。依據試驗結果得知，隨著乳酸菌含量的增加，化學發光值及ATP提取量也在上升，實驗存在較為突出的重復性。通過圖2了解到，每mL酸奶乳酸菌中含有3.98×10-8mol ATP量。故而，針對本試驗中的Fe3O4納米粒子而言，可在視頻分析檢測領域中作為載體使用。

圖2 不同溶液中ATP發光值的測定

5 結論

ATP發生發光法相對于其他微生物快速檢測方法而言，因簡單、快速便捷及較高靈敏度等優點的緣故，優勢十分突出，被廣泛運用于食品加工行業之中[6]。然而，由于外界因素極易對該方法造成干擾的緣故，對于微生物種類無法實現定性鑒別，在直接檢測個別樣品時也無法將要求的靈敏度實現[7]。故而，ATP提取劑的合理選擇、外界因素干擾的降低、微生物特異性識別的增強及檢測靈敏度的提高成為了該方法進一步改善及深入研究的重要方向。

ATP生物發光法具備103CFU/mL的檢測限，然而大部分致病菌卻呈現出10 CFU/mL的致病濃度。因免疫磁分離技術（IMS）可將濃縮、選擇性分離等作用發揮在樣品中，故而將ATP生物發光法與IMS技術結合后對細菌進行檢測，不但可將外界因素干擾降低，同時也能對微生物進行特異性識別，可實現檢測靈敏度的有效提升[8]。同時，針對熒光毛細分析法而言，在發光檢測儀中引入毛細管可實現小型化。在不斷發展的科技技術下，ATP生物發光法必然能夠更為成熟、完善，其應用領域、范圍也必然會不斷擴大。