CRISPR/Cas9技術在基因功能研究中的應用

周芮，張辟

（華中科技大學生命科學與技術學院，湖北武漢 430074）

近些年，CRISPR/Cas技術的出現為整個生物領域帶來了革命性的變化。研究者利用CRISPR/Cas9基因編輯技術可以快速、準確的實現生物體基因組編輯和動物模型構建。同時，研究人員在CRISPR/Cas9基礎上進行多種改造，將其擴展應用于基因表達調控，表觀遺傳修飾，高通量遺傳篩選，基因治療等方面。基因功能研究是當前生命科學領域的重大課題之一，將CRISPR/Cas9系統應用于基因功能研究領域，取得了眾多成果，極大地推動了該研究領域發展，對于揭示基因的生物學功能以及疾病治療具有重大意義。

1 CRISPR/Cas系統分類及作用機制

CRISPR/Cas系統是細菌為抵御外源DNA入侵進化形成的獲得性免疫系統。CRISPR/Cas基因簇由Cas蛋白的編碼基因和CRISPR基因序列組成。根據Cas基因組成，效應蛋白復合物不同以及CRISPR自身結構的不同等多個標準，CRISPR/Cas9系統主要分為兩大類，一類是形成多效應蛋白復合物的CRISPR/Cas系統，包括Ⅰ型、Ⅲ型和Ⅳ型；另一類是形成單一效應蛋白的CRISPR/Cas系統，包括Ⅱ型、Ⅴ型和Ⅵ型，其中Ⅵ型為新發現的靶向特異性RNA序列的CRISPR/Cas系統[1]。

做為細菌和古細菌的免疫系統，CRISPR/Cas系統的免疫過程大致分為3個階段。（1）適應階段。首次入侵的外源DNA的原間隔序列（Protospacer）被宿主菌中的Cas蛋白獲取，并作為間隔序列（Spacer）插入到兩段重復序列之間。（2）表達階段。當外源DNA再次入侵時，CRISPR基因座轉錄生成一段初級轉錄產物前體RNA（pre-crRNA），再由核糖核酸酶或Cas蛋白加工形成成熟的crRNA。（3）干擾階段。Cas蛋白與成熟的crRNA形成的復合體特異性識別切割外源DNA序列，造成DNA雙鏈斷裂[2]。

2 CRISPR/Cas9基因編輯技術

CRISPR/Cas9系統屬于Ⅱ型CRISPR/Cas系統，該系統不僅需要Cas9蛋白與crRNA（CRISPR RNA），還需要反式激活crRNA（Trans-activting crRNA，tracrRNA）參與CRISPR所調控的免疫過程。在CRISPR/Cas9系統中，tracrRNA會與CRISPR序列轉錄產物pre-crRNA形成復合物，該復合物與Cas9蛋白結合，經內源RNase Ⅲ和其他RNase酶加工生成成熟的tracrRNA-crRNA-Cas9蛋白復合體。隨后Cas9蛋白識別目的DNA的PAM位點（Protospacer adjacent motif)，crRNA與DNA進行堿基互補配對，識別配對成功后Cas9蛋白的兩個核酸酶結構域HNH和RucV分別切割DNA兩條單鏈，造成DNA雙鏈斷裂。之后研究者根據crRNA-tracrRNA復合體結構將其改造為sgRNA（single-guide RNA），同樣可以結合Cas9特異性識別切割靶位點[3]。因此，研究者只需根據目的基因序列設計相對應的sgRNA即可利用CRISPR/Cas9系統在含有PAM元件的靶位點造成DNA雙鏈斷裂，進而誘導DNA通過非同源末端連接（Non-homologous end joining，NHEJ）方式進行修復，隨機引入多個堿基的缺失或插入，或者通過同源重組（Homology-directed repair，HDR）方式進行自我修復，實現準確的基因敲入，達到基因編輯的目的（圖1）。研究者同時轉入多個sgRNAs即可實現對多個靶基因進行編輯，基于此特點，研究人員建立sgRNAs文庫導入細胞即可實現對基因組進行大規模定點編輯，進而CRISPR/Cas9系統被開發為高通量遺傳篩選工具。dCas9是將Cas9兩個具有切割活性的結構域RuvC、HNH同時突變失活，使其不具備核酸酶活性。dCas9雖然無法切割DNA雙鏈，但仍可以協同sgRNA特異性識別結合DNA靶序列，基于此特點，研究人員將dCas9蛋白與轉錄抑制子或轉錄激活子融合，就可以調控靶基因表達。與此同時，研究人員將dCas9與真核生物DNA甲基轉移酶，DNA去甲基化酶或組蛋白修飾酶融合，即可進行表觀基因組編輯[4]。

圖1 CRISPR/Cas9基因編輯技術原理

3 CRISPR-Cas9系統在基因功能研究領域的應用

3.1 利用CRISPR基因編輯技術進行基因功能研究

CRISPR/Cas9基因編輯技術的出現使得生物體基因編輯變得更加簡單和高效。目前，研究人員已經利用CRISPR/Cas9系統在多種細胞系和生物體中實現基因編輯，通過建立特定基因敲除或敲入的細胞系和動物模型，可以快速準確揭示生理及病理相關基因的具體功能，為疾病治療提供理論基礎。

CRISPR/Cas9技術可以幫助科研人員研究生物體生理活動相關基因的具體功能，揭示人體生理機制。Jang等[5]為研究AMPK基因在自噬小體成熟及其與溶酶體融合過程中所扮演的角色，利用CRISPR/Cas9構建AMPKα1基因敲除的HEK293T細胞系，最終實驗結果表明AMPK對于自噬小體的成熟及其與溶酶體融合非常重要。Lloyd等[6]利用CRISPR/Cas9技術構建CG7466基因無效突變果蠅，研究基因功能喪失后的相關表型，發現CG7466基因對于果蠅早期發育是必需的。豬在解剖學和生理學方面與人類極為相似，是生物醫學研究領域理想的動物模型。Sheets等[7]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術得到了NGN3基因敲除的小豬，證實NGN3基因對于豬內分泌腺發育是必需的，此類研究為在豬體內培育人體器官提供了寶貴的資源。2018年中科院等科研團隊利用CRISPR技術建立了世界首例特定長壽基因敲除的食蟹猴模型，SIRT6基因在嚙齒動物中被認為是長壽基因，但在靈長類動物中的生物學功能還未知。研究人員利用CRISPR/Cas9系統，采用一步法構建SIRT6基因在靈長類動物食蟹猴中全身敲除的模型，發現SIRT6基因敲除導致食蟹猴在子宮內出現嚴重的全身發育遲緩，并在出生數小時內死亡，該研究結果表明SIRT6基因參與調控非人類靈長類動物發育，且該成果為人類圍產期致死綜合癥研究提供可能機制，也為開展人類發育和衰老相關疾病研究奠定了基礎[8]。

CRISPR基因編輯技術也可用于研究疾病相關基因，幫助研究人員了解疾病分子機制為疾病治療提供新的途徑。Schleicher等[9]為探究PARP10基因在細胞癌變以及癌細胞增殖中的作用，利用CRISPR/Cas9技術建立了PARP10基因敲除的Hela細胞系，發現PARP10基因敲除抑制了癌細胞的增殖，且在該細胞系重新表達PARP10可以消除其對癌細胞增殖的影響，研究最終表明PARP10可能通過緩解復制壓力而促進細胞增殖以及細胞癌變，由此PARP10有望成為癌癥治療中新的靶點。遺傳性視網膜色素變性（Retinitis pigmentosa，RP)是一種神經退行性疾病，在5%～10%RP病例中檢測到EYS基因突變，但EYS基因功能以及EYS突變導致RP疾病發生的分子機制仍舊不清楚。Messchaert等[10]以斑馬魚為模型，利用CRISPR/Cas9構建EYS基因敲除型斑馬魚，結果顯示，在斑馬魚中EYS基因缺失會導致視網膜結構混亂，引起視覺功能障礙，該EYS基因缺失斑馬魚模型以后也可用于研究EYS突變導致RP疾病發生的機制。2018年，Feng[11]將CRISPR/Cas9技術與體細胞克隆技術相結合，構建了ApoE基因敲除體細胞克隆狗模型，為動脈粥樣硬化疾病的研究提供更有效的大動物模型，同時這也是世界首例基因敲除體細胞克隆犬的誕生。同年，Zhu等[12]結合CRISPR/Cas9技術和體細胞核移植技術，成功培育出世界首例亨廷頓舞蹈病基因敲入迷你豬，該研究為研發治療亨廷頓舞蹈癥新藥提供了穩定可靠的動物模型。

3.2 利用CRISPR高通量篩選技術進行基因功能研究

基于CRISPR/Cas9系統開發的高通量篩選技術更加簡單和準確，該方法可以讓研究者快速找到與某一特定表型相關的基因，揭示人類基因組功能，服務于人類疾病研究及治療。

CRISPR高通量篩選技術可用于鑒定病毒感染相關宿主基因，為病毒感染疾病治療提供新的靶標。2018年，Zhang等[13]利用張鋒實驗室建立的靶向小鼠全部基因組的GeCKOv2文庫，以3T3細胞株為模型，篩選出Mrax8受體蛋白是基孔肯雅病毒入侵宿主細胞所必需的宿主受體蛋白，且其他致關節炎甲病毒也需要Mrax8受體蛋白侵入宿主，缺少Mrax8可以減少病毒感染程度，該項研究為多種致關節炎類甲病毒感染治療提供了有效的靶標。除了進行功能喪失型篩選，研究者也可利用CRISPR/Cas9系統進行功能獲得型篩選，用于鑒定宿主細胞內具有抗病毒作用的基因，Heaton等[14]建立了針對基因啟動子的sgRNA文庫，利用CRISPR協同激活因子系統（CRISPR synergistic activation mediator，CRISPRSAM）對A549細胞株進行基因過表達篩選，發現B4GALNT2基因過表達可以阻斷全部禽流感病毒亞型感染，這項研究為抗流感感染藥物研發提供了新的靶點，也為以后篩選新的宿主因子提供參考。

基于CRISPR/Cas9系統的高通量篩選技術可以研究參與癌癥各個過程的功能基因，為癌癥治療提供更多有效途徑。Pan等[15]利用CRISPR/Cas9高通量篩選技術，使用Brie文庫，對表達Cas9的小鼠黑色素瘤BI6F10細胞進行篩選，結果顯示Pbrm1基因、Arid2基因以及Brd7基因有助于BI6F10細胞抵抗T細胞的殺傷力，而PBRM1基因失活可以使BI6F10細胞對T細胞產生的干擾素更敏感，增強T細胞介導的腫瘤攻擊反應，該項研究成果為腫瘤免疫療法提供新靶點，有望使更多患者受益于免疫療法。B細胞受體現已成為B細胞淋巴瘤的治療靶點，依魯替尼藥物是一種BTK抑制劑，在用于患者治療中僅有部分人產生應答，然而依魯替尼對具有CD79B基因突變和MYD88基因突變患者高度有效，為探究其中的原因，Phelan等[16]利用Brunello文庫對激活B細胞樣彌散大B細胞瘤細胞系進行遺傳性篩選，發現MYD88蛋白、TLR9蛋白和BCR蛋白形成了多蛋白復合體My-TBCR，該復合體可與mTOR共定位，激活NF-kB和mTOR通路，促進癌細胞存活，該研究為針對彌散性大B細胞瘤特定亞型設計藥物提供理論基礎。

近些年多項研究顯示，非編碼RNA在生物體各項生命活動中扮演重要角色，CRISPR/Cas9高通量篩選可以準確，有效用于非編碼RNA鑒定和功能分析中。2017年，Joung等[17]建立了靶向10 504個基因間IncRNA轉錄起始位點的sgRNA文庫，協同CRISPR SAM系統可用于研究IncRNA功能，之后他們以黑色素瘤細胞A375為模型篩選維洛非尼藥物抗性相關IncRNA，發現有11種IncRNA與細胞抗藥性相關，這為研究IncRNA功能以及鑒定新的IncRNA提供有效工具。2018年，Kurata等[18]建立了針對miRNA的sgRNA文庫，命名為LX-miR文庫，該文庫包含8 382個sgRNAs，可有效靶向85%已發現的miRNA，該文庫的建立使得miRNA鑒定更加便捷和準確，研究者利用該文庫篩選鑒定出影響Hela細胞和NCL-N87細胞生長的miRNA，該文庫為探究miRNA在耐藥性，病毒感染等其他方面功能提供有效平臺。

4 展望

近些年，CRISPR/Cas9技術受到眾多科研者的青睞，為基礎科學研究以及疾病治療帶來了更多的可能性。然而CRISPR/Cas9系統自身也存在一定局限性，例如脫靶效應、遞送工具問題等。針對這些問題，科研人員就多方面不斷地探尋解決方法，例如使用納米材料遞送CRISPR/Cas9系統、改變sgRNA二級結構、改變sgRNA的長度等，這些方法均對CRISPR/Cas9技術有明顯的改善作用[19-21]。與此同時，科研人員也致力于尋找新的基因編輯系統。CRISPR/Cpf1是2015年張峰實驗組報道的新型CRISPR系統，該系統相比于CRISPR/Cas9系統更加簡單，近幾年也被陸續應用于不同細胞及不生物體的基因組編輯，并且在某些生物體內檢測到更低的脫靶效應,且該系統的出現擴展了CRISPR系統作用的靶基因位點范圍[22-23]。目前，已有多種新型CRISPR/Cas系統被報道且科研人員不斷對系統進行優化改進，相信未來多種CRISPR/Cas系統將一起更好的服務于科學研究和生命健康領域。