熒光微球免疫層析技術定量檢測抗繆勒氏管激素方法的確定

李思慧，林偉強，魏趙延，吳凱

（江蘇正大天創生物工程有限公司，江蘇泰州 225300）

抗繆勒氏管激素（anti-Mullerian hormone，AMH）又稱為繆勒氏管抑制物（Mullerian inhibiting substance，MIS），是男女性腺功能重要的標志，在性腺的發育過程中起著重要作用。對于男性而言，AMH產生于睪丸支持細胞，抑制繆勒氏管的發育，從而產生誘導男性生殖管道[1]；對女性而言，AMH由卵巢的竇前和小竇狀卵泡的顆粒細胞產生，其可抑制始基卵泡的啟動，并抑制竇卵泡對卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）的敏感性，對卵泡的發育進行調節[2]。

AMH能在月經周期中相對穩定存在，且不受激素和避孕藥的影響，其檢測便于臨床應用[3-5]。抗繆勒氏管激素水平檢測能更早且準確地反映卵巢儲備功能，從而預測絕經年齡，同時在卵巢相關疾病（例如卵巢早衰、多囊卵巢綜合癥、卵巢顆粒細胞瘤等的診斷）和兒童性別發育異常的診斷及輔助生殖技術（ART）中有重要意義[6]。常用的方法有免疫細胞化學檢測、放射免疫分析技術和ELISA檢測技術，這幾種檢測技術都有著明顯的缺陷[7]。本文中采用免疫層析技術與熒光微球標記技術相結合的方式制備了能定量檢測抗繆勒氏管激素的免疫熒光層析試紙條，兼具膠體金試紙條與熒光標記技術檢測的優點，能夠方便攜帶、即時檢測且靈敏度高，便于在基層醫院進行推廣。

1 材料和儀器

AMH抗原、標記抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體、捕獲抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體及羊抗鼠IgG多克隆抗體購自杭州博茵生物，硝酸纖維素膜（包被墊）、玻璃纖維素膜（標記物墊）、吸水紙、PVC底板購自上海捷寧生物，EuropiumChelate微球購自Bangs/深圳市紐邦生物科技有限公司，各類緩沖液（包括樣品墊處理液、封閉液、保存液、復溶液、劃膜稀釋液等）試劑均為國產分析純，HM3030型三維劃膜噴金儀購自上海金標生物科技有限公司，干式熒光免疫分析儀為蘇州和邁精密儀器有限公司，電化學發光法檢測AMH試劑盒來自羅氏。

2 方法

2.1 熒光微球標記物的制備

樣品墊預處理：用XYZ三維劃膜噴金儀將樣品墊處理液噴于玻璃纖維長條上，噴量為4 μL/cm，噴后將玻璃纖維放置于烘箱內，干燥溫度37 ℃，過夜干燥。取0.2 μm微球1 mL加入1 mg NHS和1 mg EDC，室溫反應3 h，加入300 μg標記抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體，反應1 h以上。加入90 μL BSA封閉液，反應1 h以上。14 000 r/min，4 ℃，離心10 min，棄上清，加入300 μL 0.01 mol/L的磷酸緩沖溶液（pH=7.4）復溶沉淀，4 ℃保存。然后用熒光微球標記的抗繆勒氏管激素單克隆抗體溶液噴涂經預處理的樣品墊，噴量為4 μL/cm，噴后將樣品墊放置于烘箱內，干燥溫度37 ℃，過夜干燥，干燥結束后，收集密封保存。

2.2 膜處理

將另一株捕獲抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體及羊抗鼠IgG多克隆抗體分別用磷酸鹽緩沖溶液進行稀釋，用劃膜噴金儀在NC膜上按照1 mg/mL的濃度進行劃膜，含有捕獲抗體抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體的作為檢測線（T線），含有羊抗鼠多克隆抗體的作為質控線（C線），然后在37 ℃，濕度＜30%的環境下過夜干燥，待用。

2.3 組裝

將樣品墊、制備標記墊、制備的硝酸纖維素膜、吸水紙依次粘貼在PVC底板上，切裁制得寬3～5 mm的檢測試紙卡；最后將檢測試紙卡裝入卡殼制得檢測試劑盒。

3 性能評估

3.1 靈敏度實驗

取賦值的AMH企業標準品稀釋配制不同濃度的AMH校準品（0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL），用制備的抗繆勒氏管激素試紙條進行依次測定，每個濃度重復5次，以0 ng/mL作為空白對照。以抗繆勒氏管激素濃度為橫坐標，熒光讀數儀檢測信號為縱坐標，建立標準曲線。

3.2 精密度

抽取3個批次的AMH檢測試紙條，分別用濃度為0.5 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL的質控品進行檢測，每個濃度點平行測定15次，計算3個批號檢測試紙條的批內變異系數和批間變異系數。

3.3 特異性（交叉試驗）

分別用含200.0 IU/L FSH、200.0 IU/L LH的0 ng/mL的AMH液進行檢測，了解與AMH有無交叉反應。

3.4 穩定性

將成品試劑條放置在干燥的庫房中保存，每個月測試濃度為2 ng/mL（±30%）和8 ng/mL（±30%）的企業質控品，測試期為14個月。

3.5 臨床樣本檢測

在醫院采集50份檢測AMH的全血樣本，用羅氏的電化學發光法檢測AMH試劑盒與本試劑盒進行比較，對兩種方法檢測結果進行相關性和一致性分析。

4 結果與分析

本試紙條通過將免疫層析技術與熒光微球標記技術相結合的手段，利用雙抗體夾心法原理，檢測血清中AMH的濃度，試紙條結構示意圖如圖1所示。利用抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體作為標記抗體，另兩個抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體作為捕獲抗體，樣本中的AMH首先分別與標記的抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體結合，然后經過硝酸纖維素膜的層析作用，與包被在硝酸纖維素膜檢測線上的抗繆勒氏管激素（AMH）單克隆抗體結合，樣本中AMH濃度與熒光信號強度成正比，通過標準曲線即可獲得樣本中AMH的濃度。

4.1 靈敏度

抽取3個批次的AMH檢測試紙條，分別對濃度用0.05 ng/mL、0.1 ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1 ng/mL、2 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL、15 ng/mL、20 ng/mL的AMH質控品進行檢測，本試劑盒對0.05 ng/mL的樣品可以部分檢出，對0.1 ng/mL的樣品全部檢出，其最低檢出限≤0.1 ng/mL。由圖2看出，在0.1～20 ng/mL的范圍具有良好的線性，線性相關系數r≥0.990，T線顏色的深淺與樣品中抗繆勒氏管激素濃度成正比。

圖1 AMH免疫熒光層析試紙條結構示意圖

圖2 標準曲線

4.2 精密度

抽取3個批次的AMH熒光微球免疫分析試紙條，分別用濃度為0.5 ng/mL、4 ng/mL、8 ng/mL的質控品進行檢測，從表1中可以看出批間和批內變異系數均小于15%，說明AMH熒光免疫試紙條的精密度較高。

表1 試紙條精密度分析

4.3 特異性

AMH免疫熒光層析試紙條測得的特異性結果如表2所示，分別用含200.0 IU/L FSH、200.0 IU/L LH的0 ng/mL的AMH液進行檢測，均小于0.1 ng/mL，表明FSH、LH與AMH之間不存在交叉反應，本試紙條的特異性強。

表2 試紙條的特異性分析

4.4 穩定性

AMH免疫熒光層析試紙條穩定性測試結果如表3所示，在 14個月內檢測的濃度為2 ng/mL（±30%）和8 ng/mL（±30%）的企業質控品，各濃度質控品的測定結果的相對偏差均小于20%，表明該AMH試紙條有較好的穩定性，該產品有效期大于12個月。

4.5 臨床樣本檢測

用本試紙條和羅氏AMH試劑盒分別檢測50例臨床樣本，分析檢測結果的相關性，如圖3所示，回歸方程為Y=0.9957X+0.0019，R2=0.9997，平均相對偏差小于10%，結果符合臨床分析的要求，適用于臨床檢測。

圖3 AMH測定結果的相關性

表3 試紙條的穩定性分析

5 討論

AMH檢測在臨床上的應用極具意義，目前，AMH是評估卵巢刺激治療效果及預測卵巢反應的理想標志物。通過檢測AMH的水平可獲得整個生命周期中卵泡的活性應用，靈敏及特異性地預測卵巢反應[8]，指導生產預后，找出存在卵巢過度刺激綜合征風險女性，并提升體外受精的安全性和有效性。同時為兒童性別發育異常和卵巢相關疾病的診斷提供重要的參考依據，此外，可通過對AMH的檢測預測絕經期，從而為生育能力的保留提供個體化設計，幫助制定相應的生育計劃。綜上所述，AMH在臨床診斷中發揮著越來越重要的作用[6]。

本研究以熒光微球作為示蹤標記物，成功地建立了一種能夠定量檢測AMH 的熒光微球免疫層析試紙條。在試紙條中設置質控線，可增加檢測結果的可靠性，若C線無熒光信號，無論T線有無熒光信號，其結果都視為無效。試紙條的最低檢測限最低檢出限≤0.1ng/mL，具有較高的精密度和特異性。穩定性檢測結果表明，連續14個月內檢測兩種AMH質控品[2 ng/mL（±30%）和8 ng/mL（±30%）]，各濃度質控品檢測結果的相對偏差均在允許范圍內（小于20%），表明試劑盒的有效期大于12個月，與羅氏電化學發光法檢測AMH試劑盒相比具有很高的一致性。此外，用該方法檢測AMH，成本低且操作簡單，能夠在社區基層醫院中廣泛推廣，而且還能夠滿足大型醫院內因病患流量大而需快速檢測的要求，是一種臨床上檢測抗繆勒氏管激素便捷可靠的方法。