河北唐山地區奶牛早期妊娠診斷技術應用與推廣

文/石有權 張進紅

（1 河北省灤州市農業農村局；2 河北省唐山市畜牧工作站）

近年來，我國奶牛養殖業正經歷著從單純的規模化、集約化生產方式向標準化、現代化生產方式轉變，目前已成為資本、技術雙密集型行業。2015—2017年期間，唐山市每年的奶牛存欄量在40 萬頭以上，居全省前列，是奶牛養殖大市。其中，存欄300 頭及以上規模的奶牛場（區）達到了300 多個，奶業一直是唐山市傳統優勢產業。但與奶牛養殖發達國家及國內發達地區相比，唐山市奶牛飼養管理整體水平差距較大，尤其體現在奶牛早期妊娠診斷方面。

2015—2017 年河北省唐山地區開展奶牛早期妊娠診斷技術推廣，本項目所推廣的奶牛早期妊娠診斷方法，是通過檢測妊娠相關物質——妊娠相關蛋白 （Pregnancy Associated Glycoprotein，PAGs），來判斷該牛是否懷孕的一種準確、快速、操作便捷的檢測方法。該方法對妊娠第28天及以后的母牛血液中PAGs濃度進行檢測和判讀，進而判斷該母牛是否已經妊娠，該技術具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優點。其優勢主要體現在以下七大方面：（1）配種后28 天準確判定空懷牛只，及時做出繁殖管理決策；（2）空懷檢測準確率高，達到99.9%以上；（3）縮短空懷天數，降低飼料成本，提高繁殖率；（4）尾根靜脈采血檢測，對牛體傷害小，利于胚胎安全，不會由于早期觸摸胚胎發生胚胎損失；（5）可實現大批量檢測，不僅適用于小規模養殖場，尤其適宜現代化大型規模化牛場使用；（6）體外操作，大大降低了人畜共患病的感染幾率，降低牛只間交叉感染和疫病傳播的風險；（7）技術操作誤差小，減少繁殖人員的工作強度。

1 奶牛早期妊娠診斷技術要點

1.1 奶牛早期妊娠診斷的操作流程

1.1.1 樣品的采集

采集配種后28 天及以上天數的母牛血樣，分離血清，以備檢測。

1.1.2 試劑準備

（1）在使用之前，所有的試劑必須恢復到18～26 ℃。

（2）應通過輕輕渦旋、旋轉混合均勻。（3）移液器和吸頭的準備，確保每個樣本1 個吸頭。

（4）使用蒸餾水或去離子水對濃縮洗滌液進行10 倍稀釋（每個反應板條需10 mL濃縮洗滌液加入90 mL水中）。

1.1.3 檢測操作

（1）試劑及樣品的加入

在所有樣品和對照孔內滴加1 滴樣品稀釋液，確保每個樣品1 個吸頭。用移液器、吸頭吸取陰性對照并分別加入2 個孔內，吸取陽性對照分別加入2 個孔內，吸取樣品（血清）并加入適當孔內，輕彈微量反應板，使其反應板中的溶液混勻，蓋好蓋板，在室溫下孵育30 min（可以有誤差2 min）。 孵育完成后，移除蓋板，快速翻轉反應板，將板孔內液體棄入廢液缸或水槽，用裝有洗滌溶液的洗瓶洗板3～5 次。

（2）檢測溶液加入

在每個反應孔中加入2 滴檢測溶液，蓋好板蓋，在室溫下孵育30 min（可以有誤差2 min），再次進行洗板3～5 次。

（3）酶標抗體加入

在每個反應孔中加入2 滴酶標抗體，蓋好板蓋，在室溫下孵育30 min（可以有誤差2 min），再次進行洗板3～5 次。

（4）底物液和終止液加入

在每個反應孔中加入2 滴TMB底物溶液，室溫下孵育15 min（可以有誤差1 min），此步驟必須避光操作。后在每個反應孔中加入2 滴終止液終止反應。注意：在加終止液時要按加入底物溶液的順序進行滴加，輕彈微量反應板將反應板中的溶液混勻。

1.1.4 讀板及結果判定

動物的妊娠狀態是由肉眼觀察孔內顏色決定的，若與陽性對照孔呈藍色的為陽性，與陰性對照孔顏色相似為空懷，如樣品孔顏色很難用肉眼分辨，則認為可疑/疑似，推薦妊娠復檢。

1.2 試劑盒及相關耗材的儲存

試劑儲存于2～8 ℃環境條件下。

1.3 檢測結果的判斷及相應處理

1.3.1 為了保證試驗的有效性，陽性對照孔必須變藍。如果陽性對照孔沒有變藍，試驗結果是無效的，則需要根據說明書重新進行試驗。

1.3.2 對比樣品和陰性對照呈現顏色，如兩個孔的顏色難以用肉眼分辨，則被認為可疑或疑似，建議重新采樣復檢。

1.3.3 檢測結果為陰性，則判定該母牛為空懷，但在對該母牛進行下一步處理，尤其是同期發情處理前，應足夠慎重，避免出現因本次處理而人為導致的妊娠母牛流產。

1.3.4 在奶牛妊娠早期，胚胎死亡是很常見的現象。而在胚胎死亡的早期，PAGs蛋白會在母牛體內循環。可以在一段時間后重新采樣進行妊娠復檢，也可采用其他妊娠檢測方法確認。生產負責人應與獸醫一起制定出適合于本場的繁殖管理程序。

1.4 其他注意事項

嚴格按照產品使用說明操作，嚴格按照操作程序進行操作，為了得到較好的試驗結果，還應注意以下幾點：（1）把所有的生物材料當作潛在的傳染源來處理，在處理樣品時佩戴防護手套、穿防護服、戴防護眼鏡及防護面罩，用過的材料要無害化處理。（2）小心操作，防止試劑盒組分污染。（3）不要使用過期的試劑盒。

2 唐山地區奶牛早期妊娠診斷技術推廣應用情況

2.1 開展奶牛養殖情況調查及結果分析

2015年1 月開展了全市奶牛養殖情況調查，包括各主要縣市區能繁母牛數、目前采用的妊娠診斷方法、妊娠診斷時間、平均空懷天數、配種期母牛日均采食量和飼料成本等情況。根據調查結果分析，本次共調研規模奶牛場225 個，其中，在妊娠診斷方法方面，217 個場采用直腸觸診（PPR）法，占比96.44%；8 個場采用或結合采用B超法，占比3.56%；沒有牛場采取利用早期孕檢試劑盒等產品的早期妊娠檢測方法。具體調查情況統計如表1。

2.2 多點控制試驗示范過程與結果

2015年2 月—9月，試驗期8個月，選定3 個養殖場為試驗場，灤縣興源奶牛場為實驗一場、豐潤區建泉奶牛場為實驗二場、豐南中奧奶牛場為實驗三場，各試驗場均采用自繁自育方式，在開展本試驗之前，進行了預試驗，對該早期妊娠診斷技術的準確率和時效性進行驗證。

表1 唐山市奶牛養殖調查統計表

2.2.1 開展預試驗，驗證該技術的準確性

（1）試驗時間、地點及試驗動物

2015年2月5 日，在實驗一場即灤縣興源奶牛場選出20 頭母牛進行預試驗，其中，未配種母牛3 頭、配種在70 天以上并經直腸觸診確認已妊娠母牛3 頭、已經輸精28 天待檢母牛14 頭。（2）試驗方法

當天對所有試驗母牛進行尾根靜脈采血，收集到20 個血液樣品，嚴格按照操作規程及時檢測和結果判讀；在最后1 次輸精后60 天由經驗豐富的獸醫進行直腸觸診，檢查其是否妊娠。

（3）結果與分析

應用“奶牛早期妊娠診斷技術”對20 個樣品進行檢測，其結果與牧場后期直腸觸診（PPR）方法檢測結果對照情況見表2。

由表2可知，檢測結果顯示為陽性有15 頭，陰性有5 頭。檢測結果為陽性的樣品中，05號、15號、20號樣品對應的母牛為配種60 天以上并經直腸觸診確認已妊娠母牛，檢測結果與實際情況一致；其余13個樣品對應的母牛的60 天觸診結果也為妊娠，檢測結果與后期驗證結果一致。檢測結果為陰性的樣品中，02號、06號、10號樣品對應的母牛為未配種奶牛，檢測結果與實際情況一致；08號、17號樣品對應的母牛的60天觸診結果也為空懷，檢測結果與后期驗證結果一致。結論：該技術對配種28 天及以后母牛的妊娠診斷準確率100%；空懷診斷準確率100%。

2.2.2 正式試驗

（1）試驗時間、地點及試驗動物

2015年2 月初開始，在3 個試驗場同時開展正式試驗。試驗對象為全群1～5 胎成母牛。

2014年成母牛配種妊娠、產犢情況作為該試驗的對照組，2015年2—8月的配種、妊娠、產犢情況作為試驗組。

（2）試驗方法

2015年2—9 月，對配種后28～30 天未返情的母牛采集血樣送試驗室，使用該技術進行妊娠診斷，根據試驗室反饋的檢測結果由技術人員對檢出的空懷牛及時處理，再次誘導排卵，而后進行人工授精，在輸精后28 天再次采血檢測。對應用該技術前后3 個試驗場的奶牛空懷天數變化情況進行統計。

表2 PAGs檢測結果與60 天妊娠檢測結果對照表

表3 應用該早期妊娠診斷方法前后平均空懷天數對照統計表

（3）數據統計與分析

采用SPSS軟件對數據進行分析，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2.2.3 結果與分析

應用該技術前后3 個試驗場奶牛平均空懷天數變化結果見表3。

由表3可見，應用該技術前后，實驗一場平均空懷天數分別是156.73 天和134.06 天，減少22.67天，差異極顯著（P＜0.01）；實驗二場平均空懷天數分別是152.05天和130.25 天，減少21.80 天，差異極顯著（P＜0.01）；實驗三場平均空懷天數分別是160.53 天和136.05 天，減少24.48 天，差異極顯著（P＜0.01）；3 個實驗場共統計了1 591 頭和1 716 頭奶牛，平均空懷天數分別是155.74 天和132.97 天，減少22.77 天，差異極顯著（P＜0.01）。

通過應用該技術，3 個試驗場平均有效減少奶牛空懷天數22.77 天，降低了飼喂成本，3 個試驗場每頭牛能夠平均累計新增效益=平均有效減少奶牛空懷天數（22.7 天）×每頭牛每天的飼料成本（45.5 元/頭）-每頭牛新增的生產費用（每頭牛檢測用試劑盒成本平均為35 元/頭）=22.77×45.5-35=1 001.04 元。