四川煙草主栽區根際促生菌篩選及促生菌系構建

吳 翔，甘炳成*，唐 亞，譚 昊，黃忠乾，謝麗源，彭衛紅，唐 杰，周 潔，陳 影

1. 四川省農業科學院土壤肥料研究所 農業部西南區域農業微生物資源利用科學觀測實驗站/農業部西南山地農業環境重點實驗室，成都市外東獅子山路4 號 610066

2. 四川大學建筑與環境學院，成都市一環路南一段24 號 610065

植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指定殖于根系，能直接或間接促進植物生長的微生物［1]。雖然根際促生菌的促生機制尚不明確，但它具有產吲哚乙酸（Indole-3-acetic acid, IAA）［2-3]、產鐵載體［4-6]、產氰化物［7-10]、溶磷［11-14]及抑制病原菌生長［15-16]的功能。目前，PGPR 的研究主要集中在小麥［7,9]、水稻［17]、玉米［18]等主要糧食作物上，其他作物研究較少。植物生長素IAA 被當作篩選PGPR 的重要指標，根際促生菌通過分泌IAA 來促進植物合成生長調節物質，從而促進植物的生長發育［19-20]。

煙草是我國重要的經濟作物，種植廣泛。攀枝花市、宜賓市、瀘州市、涼山州和廣元市是四川省5 大煙草種植區。目前，四川省煙草主栽區根際土壤促生菌的研究鮮見報道。為此，從四川省5大煙草種植區采集煙草根際土壤，從中分離、篩選高效的促生菌，旨在豐富促生菌資源，為煙草促生生物肥料的研發提供基礎。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集及根際微生物的分離

去除植株根際約5 cm 厚的表層土壤后，采集1 kg 土壤樣品，立即帶回實驗室進行微生物分離。微生物分離采用稀釋平板法［21]，培養基為牛肉膏蛋白胨培養基、高氏1 號和PDA 培養基。對分離到的菌株進行編號，編號規則：①細菌編號，樣品編號-B-菌株號；②放線菌編號，樣品編號-A-菌株號；③真菌編號，樣品編號-F-菌株編號。每個菌株接種到3 支試管中，4 ℃冰箱保藏，用于功能菌株的篩選。

表1 樣品采集信息Tab.1 Basic sample information

牛肉膏蛋白胨培養基：牛肉浸膏3.0 g，蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 L，pH 6.8～7.2。

高氏1號 ：KNO31.00 g，K2HPO40.50 g，MgSO4·7H2O 0.50 g，NaCl 0.50 g，FeSO4·7H2O 0.01 g，可溶性淀粉20.00 g，瓊脂20.00 g，蒸餾水1.00 L，pH 7.2～7.4。

PDA 培養基：土豆200.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，蒸餾水1.0 L，pH 自然。

1.2 促生微生物IAA 初篩

參照席琳喬等［22]的方法對促生微生物進行IAA 初篩。取50 μL 菌懸液滴于白色陶瓷板上，同時 加50 μL Salkowski 比色液 。 以 加50 μL IAA（50 mg/L）溶液為陽性對照，以加LB 培養基為陰性對照。菌懸液變紅的程度高于陰性對照則表示微生物能夠產IAA，根據變紅的程度可初步判斷其產IAA 能力的大小。

Salkowski 比色液：35.0% HClO450.0 mL，0.5 mol/L FeCl31.0 mL。

LB 液體培養基：胰蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1 L，pH 7.4。

為把改進成果納入標準化，須把各種設計資料、圖紙整理存檔，納入本單位標準化管理工作中，制定《柱塞總成的操作規程與維護規定》，以文件形式下發到了各班組，并納入檢修規程中。同時重點要做好以下工作：

1.3 產IAA 能力的檢測

使用UVmini-1240 型分光光度計（日本島津公司）測定不同濃度IAA 溶液在530 nm 處的吸光值，以IAA 濃度為橫坐標，OD530為縱坐標，繪制標準曲線。將初篩菌株接種于LB 液體培養基中，培養24 h，4 000 r/min 離心15 min。取4 mL 上清液在530 nm 處進行吸光度測定，并計算IAA 產量，每個菌株重復3 次。標準曲線的制作和菌液中IAA 濃度的測定參照Glickmann 等［23]的方法。標準曲線的空白對照為蒸餾水∶Salkowski 比色液=1∶1 的混合液，菌液檢測的空白對照為LB 液體培養基∶Salkowski 比色液=1∶1 的混合液。

1.4 產鐵載體能力的鑒定

將初篩菌株接種于鐵載體檢測培養基，以不接菌的檢測培養基為空白對照。根據檢測培養基上菌落周圍是否產鐵載體暈圈判定其是否具有產鐵載體的能力［24]。鐵載體檢測培養基的配置：將無菌的50 mL 0.l mol/L 磷酸緩沖溶液、無菌的50 mL CAS 染液直接加入到1 L 鐵載體檢測基礎培養基中，混勻。

CAS 染液 ：l.0 mmol/L 鉻天青S，0.1 mmol/L FeC13，4.0 mmol/L 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）。

鐵載體檢測基礎培養基：0.5 g KCl，0.5 g MgSO4，4.0 g 葡萄糖，5.0 g 酪蛋白胨，15.0 g 瓊脂，1.0 L 蒸餾水，pH 7.0～7.2。

0.1 mol/L 磷酸緩沖液 ：0.590 5 g NaH2PO4·2H2O，2.427 0 g Na2HPO4·12H2O，0.250 0 g NH4Cl，0.075 0 g KH2PO4，0.125 0 g NaCl，100.00 mL蒸餾水。

1.5 產氰化氫（HCN）能力的鑒定

參 照Lorck［25]的方法檢測菌株產HCN的能力。將初篩菌株接種于添加4.4 g/L 甘氨酸的牛肉膏蛋白胨培養基上后，再用浸過2%碳酸鈉、0.5%苦味酸溶液（2,4,6-三硝基苯酚）的Whatman1 號濾紙覆蓋，（28±2）℃培養4 d。濾紙顏色由橘黃色轉為紅色說明有HCN 產生，根據轉紅的程度判斷菌株產HCN的效果。以不接菌的培養基為空白對照。

1.6 促生菌系的構建

將復篩后的促生菌株進行組合，不同組合的菌株接種到裝有LB 液體培養基的三角瓶中，30 ℃ 、180 r/min 培 養24 h。利用IAA測定方法（1.3 節）檢測并計算各組合IAA 的產量，以不接菌的LB 液體培養基為對照，每個組合重復3 次。

1.7 菌株16S rDNA序列的測定及系統發育樹構建

參照細菌基因組DNA 提取試劑盒（杭州博日科技有限公司）的說明書提取細菌基因組DNA。參照張飛官等［26]的方法擴增菌株16S rDNA。PCR 產物在生工生物工程（上海）有限公司進行測序。將測得的16S rDNA 序列提交到GenBank，獲得各菌株的登錄號。參照張越己等［15]的方法構建系統發育樹。

1.8 種子發芽試驗

將促生菌株和構建的促生菌系分別接入LB液體培養基中，30 ℃、180 r/min 培養24 h。菌懸液的終濃度為107cfu/mL，以未接菌的LB 液體培養基為空白對照。挑選紅花大金元、MS 云煙85和MS 云煙87（由四川省煙草公司攀枝花市公司米易分公司惠贈）個體飽滿、大小一致的裸種，每個品種20 粒種子，均勻播于鋪有2 層濾紙的無菌培養皿中，每個品種3次重復。每個培養皿加入4 mL制備好的菌懸液和10-1倍濃度的LB 液體培養基，每種菌液3 次重復，置于人工智能氣候箱中培養。培養條件：光強70%、光照12 h、溫度25 ℃、相對濕度70%，每隔1 d 補充1 mL 無菌水，以確保種子正常萌發，于第3、第7 天統計發芽率。

發芽率=（發芽種子數/檢測種子總數）×100%

2 結果與分析

2.1 根際微生物的分離

從不同地點、不同取樣時間的63 個土壤樣品中，共分離出923 株微生物，其中細菌583 株、放線菌234 株、真菌106 株，基本情況見表2。

表2 樣品微生物的分離情況Tab.2 Microorganism isolation results

2.2 促生菌的篩選

從923 株菌株中，初篩到具有較好產IAA 能力的菌株66 株，包括62 株細菌，占比為93.94%，4 株放線菌，占比為6.06%。通過測定菌株IAA 的產量、是否產鐵載體和HCN 進行復篩。結果（表3）表明，初篩的66 株菌株IAA 的產量在2.65～42.99 μg/mL 之間，其中菌株L2-001-B-16 產IAA 的能力最強。IAA 產量排前10 的菌株：L2-001-B-16＞MT-002-B-12＞FY-001-B-9＞YBT-003-B-5＞YB-001-B-8＞L2-001-B-14＞L2-002-B-2＞L2-006-B-16＞L2-004-B-2＞SC-118-B-1。對66 株菌株是否具有產鐵載體、HCN 的能力進行檢測發現，24 株菌株具有產鐵載體能力（表3），11 株菌株具有較好產HCN的能力（表3）。以同時具有較好產IAA、鐵載體和HCN 能力的菌株為復篩菌株，包括L2-001-B-16、MT-002-B-12、FY-001-B-9、YBT-003-B-5、YB-001-B-8。

表3 初篩菌株促生能力的檢測Tab.3 Promoting ability results from first-screening strains

表3（續）

2.3 促生菌系的構建

將5 株復篩菌株進行組合，共31 個組合，測定這些組合產IAA 的能力（表4）。在2 個菌株的組合中，組合45 IAA 的產量最高；在3 個菌株的組合中，組合134 IAA 的產量最高。在31 個組合中，組合1345 產IAA 的能力最高，其IAA 的產量為51.27 μg/mL，極顯著優于其他組合。因此，組合1345 為最優促生菌系。

表4 促生菌系產IAA 能力的檢測①Tab.4 IAA yields of different growth-promoting rhizobacteria groups

2.4 16S rDNA 序列分析

進一步分析組合1345 的4 株菌株16S rDNA序列。菌株MT-002-B-12、FY-001-B-9 和YBT-003-B-5 的16S rDNA 序列長度分別為1 402、1 354、1 516 bp，在GenBank中的登錄號分別為KT119350、KT119349、KT223830。根據系統發育與菌株形態特征，判定菌株MT-002-B-12 屬于克雷伯氏菌屬的Klebsiella variicola，菌株FY-001-B-9 屬于腸桿菌屬的Enterobacter xiangfangensis，菌 株YBT-003-B-5 屬于芽孢桿菌屬的Bacillus tequilensis。

菌株L2-001-B-16 的16S rDNA 序列長度為1 510 bp。系統發育分析結果（圖1）表明，菌株L2-001-B-16 屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae），與Enterobacter cloacae subsp. Dissolvens 的發育關系最近，二者16S rDNA 序列相似性為92.2%；其次是Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae，16S rDNA序列相似性為91.9%；與腸桿菌科其他菌株的相似性均小于91.8%。因此，推測菌株L2-001-B-16 是腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的新類群。

圖1 菌株L2-001-B-16 的系統發育樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain L2-001-B-16 based on 16S rDNA

2.5 對種子萌發的影響

由表5 可知，與對照相比，不同菌株處理下，3 個煙草品種種子第3 天的發芽率均極顯著升高。第7 天，菌株YBT-003-B-5 對紅花大金元種子、菌株MT-002-B-12 對MS 云煙87 種子發芽率的影響均不顯著；其余菌株處理下，3 個煙草品種種子的發芽率均極顯著升高。第3 天和第7 天，在組合1345 的處理下，3 個煙草品種種子的發芽率均高于其他菌株，促進煙草種子發芽的效果明顯。

表5 不同促生菌對煙草種子發芽率的影響Tab.5 Effects of different growth-promoting rhizobacteria on germinating rates of tobacco seeds

3 討論

席琳喬等［22]從棉花根際土壤中分離到8 株根際促生固氮菌，其IAA 的產量在6.62～22.83 μg/mL之間；劉靜洋［27]篩選到29 株棉花根際細菌，其IAA的產量在0.15～22.87 mg/L 之間；徐明雙［28]發現31株內生菌分泌IAA的產量為1.00～5.49 mg/L；鄭文波等［29]發現菌株ZH5 IAA的產量為43.18 mg/L。從四川省煙草主栽區的根際土壤中分離到5 株（YBT-003-B-5、YB-001-B-8、FY-001-B-9、MT-002-B-12、L2-001-B-16）促生菌，所構建的促生菌系（MT-002-B-12、L2-001-B-16、FY-001-B-9 和YBT-003-B-5）IAA產量可達51.27 mg/L，高于已報道的促生菌產IAA 的能力［22，27-29]，并且該促生菌系還能顯著提高煙草種子的發芽率。

促生菌系中的菌株MT-002-B-12、FY-001-B-9和YBT-003-B-5 分 別 屬 于Klebsiella variicola、Enterobacter xiangfangensi 和 Bacillus tequilensis。K. variicola 具有ACC 脫氨酶活性［30]、固氮［31-32]、解鉀［33]等促生功能；E. xiangfangensis 具有產組胺的能力［34]；B. tequilensis 具有促生［35]、產拮抗病原菌活性物質的能力［36-37]。但目前還沒有關于這3 種細菌產IAA、鐵載體和HCN 能力的報道。另外，菌株L2-001-B-16 可能屬于腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的新類群。本研究中，獲得的促生菌株豐富了促生微生物的種類，為利用微生物研制煙草生物肥料提供了更多的選擇。

4 結論

①從四川省5 個煙草主栽區的煙草根際土壤中分離到923 株微生物，其中細菌583 株、放線菌234 株、真菌106 株；②初篩篩選到具有較好產IAA能力的菌株66 株，復篩篩選出5 株具有較好產IAA、產鐵載體和產HCN 能力的菌株；③將菌株MT-002-B-12、L2-001-B-16、FY-001-B-9 和YBT-003-B-5 構建成促生菌系，該促生菌系能極顯著促進3個煙草主栽品種種子的萌發。