遺傳性嗜鉻細(xì)胞瘤家系血漿兒茶酚胺及其代謝物的含量測(cè)定

劉洪旭 鄧思珊 馬麗紅 馬振菁 王新康

[摘要] 目的 建立高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)器（HPLC-ECD）法測(cè)定遺傳性嗜鉻細(xì)胞瘤家系血漿兒茶酚胺及其代謝產(chǎn)物的含量的方法。 方法 工作電極為玻璃電極，參比電極為Ag-AgCl電極，電壓0.6 V，溫度30℃。色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）;以甲醇為流動(dòng)相A，0.1%磷酸二氫鈉（含EDTA-Na和辛烷磺酸）水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速為0.8 mL/min;柱溫為室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm;進(jìn)樣量：20 μL。 結(jié)果 正常健康人中腎上腺素（E）、去甲腎上腺素（NE）、甲氧基去甲腎上腺素（NMN）、甲氧基腎上腺素（MN）分別為（56.71±25.67）、（98.62±36.90）、（78.36±22.36）、（33.27±14.62） ng/L。嗜鉻細(xì)胞瘤家系中確診的2例嗜鉻細(xì)胞瘤患者的NE分別為353.36、563.87 ng/L和NMN分別為425.71、527.65 ng/L，其余18位家屬的相關(guān)檢測(cè)值在正常健康成人的范圍內(nèi)，其他2位家屬的相關(guān)檢測(cè)值比正常值高，建議去醫(yī)院進(jìn)一步檢查。 結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便，靈敏、準(zhǔn)確，可用于臨床嗜鉻細(xì)胞瘤患者的檢測(cè)。

[關(guān)鍵詞] 高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)器;嗜鉻細(xì)胞瘤;兒茶酚胺;代謝

[中圖分類(lèi)號(hào)] R586.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）02（c）-0113-04

[Abstract] Objective To establish a method for the determination of catecholamines and their metabolites in plasma of hereditary pheochromocytoma families by high performance liquid chromatography-electrochemical detector （HPLC-ECD）. Methods The working electrode was a glass electrode and the reference electrode was an Ag-AgCl electrode with a voltage of 0.6 V and a temperature of 30℃. Using Ultimate XB-C18 （4.6 mm × 150 mm， 5 μm）; using methanol as mobile phase A， 0.1% sodium dihydrogen phosphate （containing EDTA-Na and octanesulfonic acid） aqueous solution as mobile phase B， gradient elution， flow rate 0.8 mL/min; column temperature was room temperature; detection wavelength was 280 nm; injection volume was 20 μL. Results In normal healthy people， the contents of epinephrine（E）， norepinephrine（NE）， methoxy norepinephrine （NMN）， methoxy-adrenalin （MN） were （56.71±25.67）， （98.62±36.90）， （78.36±22.36）， （33.27±14.62） ng/L. The NEs of 2 patients with pheochromocytoma diagnosed in pheochromocytoma were 353.36， 563.87 ng/L and NMN were 425.71 and 527.65 ng/L， respectively. The correlation detection values of the other 18 family members were within the range of normal healthy adults. The correlation detection values of the other two family members were higher than the normal values. it is recommended to go to the hospital for further examination. Conclusion This method is simple， sensitive and accurate and can be used for the detection of patients with clinical pheochromocytoma.

[Key words] High performance liquid chromatography-electrochemical detector; Pheochromocytoma; Catechol-amine; Metabolize

兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)是由腎上腺髓質(zhì)分泌的一類(lèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，主要包括腎上腺素（epinephrine，E）、去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和多巴胺等，嗜鉻細(xì)胞瘤患者持續(xù)或間斷地釋放大量?jī)翰璺影奉?lèi)物質(zhì)作用于腎上腺素能受體，引起持續(xù)性或陣發(fā)性高血壓伴頭痛、多汗、心悸三聯(lián)癥狀，繼而會(huì)引起多個(gè)器官功能及代謝紊亂[1-2]。患者可因長(zhǎng)期高血壓致嚴(yán)重的心、腦、腎損害或因突發(fā)嚴(yán)重高血壓而導(dǎo)致危象，危及生命，但如能及時(shí)、早期獲得診斷和正確治療，90%的患者可以治愈。因此，檢測(cè)血液兒茶酚胺對(duì)臨床診斷嗜鉻細(xì)胞瘤具有重要意義[3-5]。臨床主要采用比色法和放射免疫法檢測(cè)E和NE，其干擾較多，無(wú)法滿足生物樣品的檢測(cè)[6]。近年來(lái)，分析儀器發(fā)展較快，研究人員開(kāi)發(fā)了更靈敏、更特異的高效液相色譜法來(lái)檢測(cè)上述物質(zhì)，其具有樣本用量較少、特異性和靈敏度高的特點(diǎn)，在臨床化學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域有著較廣泛的應(yīng)用[7～10]。兒茶酚胺代謝產(chǎn)物包括甲氧基去甲腎上腺素（normetanephrine，NMN）和甲氧基腎上腺素（metanephrine，MN），其經(jīng)單胺氧化酶氧化為香草扁桃酸，最終經(jīng)腎臟由尿液排泄。血漿游離型代謝物主要來(lái)源腫瘤細(xì)胞，其與兒茶酚胺長(zhǎng)期分泌增加有關(guān)，不受腎上腺交感神經(jīng)興奮影響[11]，且半衰期相對(duì)較長(zhǎng)[12]，不易產(chǎn)生波動(dòng)。通過(guò)檢測(cè)代謝物能夠更準(zhǔn)確反映嗜鉻細(xì)胞瘤兒茶酚胺合成的真實(shí)情況[13-15]。本研究旨在建立采用高效液相色譜-電化學(xué)檢測(cè)器（HPLC-ECD）法測(cè)定一家族性嗜鉻細(xì)胞瘤家系的血漿E、NE及其代謝產(chǎn)物NMN和MN的含量，為家系嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷和預(yù)期提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters液相色譜儀配L-ECD-6A電化學(xué)檢測(cè)器及柱溫箱（美國(guó)Waters公司）;離心機(jī)、電子分析天平（瑞士）、MilliQ純水系統(tǒng)（Millipore公司）、渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠）。

1.2 試藥

腎上腺素對(duì)照品（批號(hào)：100154-201104）、去甲腎上腺素對(duì)照品（批號(hào)：100169-201103）、甲氧基去甲腎上腺素對(duì)照品（批號(hào)：1-ATH-165-1）、甲氧基腎上腺素對(duì)照品（批號(hào)：2-MSC-183-6）、內(nèi)標(biāo)物4-羥基-3甲氧基胺酸鹽（批號(hào)：1-LJC-56-1）均為加拿大Toronto research Chemicals公司產(chǎn)品。甲醇（色譜純，上海星可生化有限公司）。其他試劑均為分析純。

2方法與結(jié)果

2.1 樣本獲取

選取2017年4～6月福建省醫(yī)科院職工和福建省立醫(yī)院實(shí)習(xí)學(xué)生30名，均為健康成人，男女各15名，年齡20～45歲，血壓均在正常范圍（收縮壓：90～139 mmHg，舒張壓：60～89 mmHg，1 mmHg=0.133 kpa）。選取2017年6月中國(guó)漢族東南地區(qū)1個(gè)嗜鉻細(xì)胞瘤家系，4代共22人，其中確診2例。本研究經(jīng)福建省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院倫理委員會(huì)同意，所有受試者及其家系成員均簽署知情同意書(shū)，并自愿提供外周血樣本。

受試者早晨空腹，休息15 min后使用肝素鈉抗凝真空管采集患者靜脈血。3500 r/min離心10 min，離心半徑為25 cm，分離血漿，于-80℃凍存。

2.2 色譜條件

電化學(xué)檢測(cè)條件：工作電極為玻璃電極，參比電極為Ag-AgCl電極，電壓0.6 V，溫度30℃。色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）;以甲醇為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸二氫鈉（含EDTA-Na和辛烷磺酸）水溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫;流速：0.8 mL/min;柱溫：室溫;檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm;進(jìn)樣量：20 μL。洗脫梯度：0～2 min 10%A，2～5 min 10%A→30%A，5～30 min 30%A。

2.3 供試品溶液的制備

取血漿2 mL，加10%偏重亞硫酸0.2 mL，5%EDTA 5 mL，內(nèi)標(biāo)物4-羥基-3甲氧基胺酸鹽（0.4 mg/mL）50 μL，加5 g酸洗氧化鋁，混勻，調(diào)pH值8.4～8.5，攪拌10 min，棄去上清液，氧化鋁用純凈水洗滌2次，每次10 mL，最后在氧化鋁中加入0.04%高氯酸1 mL，攪拌，混合均勻，震蕩2 min，吸取上清液，即得。

2.4 對(duì)照品溶液制備

精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品E、NE、NMN和MN適量，置于10 mL容量瓶中，加入0.04%高氯酸溶解并稀釋到刻度配置成0.2 mg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液，分裝后置于-70℃冰箱凍存。內(nèi)標(biāo)溶液：精密稱取內(nèi)標(biāo)物適量，用0.04%高氯酸配制成100 ng/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與最低檢測(cè)限

本研究以正常人血漿為基質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。將配置好的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋為系列混合標(biāo)準(zhǔn)液，加入到混合血漿中，按照“2.3”項(xiàng)下制備。以待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比減去基質(zhì)中待測(cè)物峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積之比為Y，待測(cè)濃度為X，權(quán)重因子W=1/X，作加權(quán)回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以S/N=3確定檢測(cè)限。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.6 精密度

取同一份混合對(duì)照品，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.2”色譜條件測(cè)定，記錄各物質(zhì)的色譜峰峰面積。E、NE、MN和NMN的RSD分別為1.25%、2.05%、0.98%及0.82%，表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性

按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備的樣品，放置0、2、4、8、10 h后，分別精密吸取20 μL，注入色譜儀，按“2.2”色譜條件測(cè)定，記錄各色譜峰峰面積。E、NE、MN和NMN的RSD分別為1.69%、2.01%、1.15%及1.32%，表明血漿內(nèi)物質(zhì)在10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性

按“2.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備5份樣品溶液，按“2.2”色譜條件測(cè)定。E、NE、MN和NMN的RSD分別為1.41%、1.58%、1.26%及0.98%（n = 5），表明該方法的重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

分別添加E、NE、MN和NMN的高、中、低三種濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液到混合血漿標(biāo)本中，按“2.3”項(xiàng)下操作，測(cè)定加標(biāo)前后標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的濃度，每個(gè)濃度平行測(cè)定3次。血漿樣本4種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的平均回收率為87.6%～116.4%，高、中、低濃度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在血漿中回收率良好。見(jiàn)表2。

2.10 樣品測(cè)定

取30名健康成人的血漿，按照“2.3”項(xiàng)下操作制備供試品溶液，按“2.2”的色譜條件測(cè)定，記錄各物質(zhì)的色譜峰的峰面積。

選取嗜鉻細(xì)胞瘤家系，4代共22人，其中2人為確診患者。經(jīng)色譜方法檢測(cè)，確診的2位嗜鉻細(xì)胞瘤患者的NE分別為353.36、563.87 ng/L，NMN分別為425.71、527.65 ng/L，其余18位家屬中檢測(cè)值在正常健康成人范圍，其他2位NE分別為234.54、198.32 ng/L，其N(xiāo)MN分別為198.36、178.65 ng/L，比正常值高，建議去醫(yī)院進(jìn)一步檢查。

3 討論

近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)診療技術(shù)的發(fā)展，內(nèi)分泌代謝病的理論與實(shí)踐水平也有大幅度提高，國(guó)內(nèi)對(duì)嗜鉻細(xì)胞瘤病例的研究和報(bào)道也越來(lái)越多，對(duì)嗜鉻細(xì)胞瘤病例的臨床特征觀察趨于細(xì)致，治療手段也更為豐富，對(duì)嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷、鑒別診斷和療效觀察無(wú)疑會(huì)起到有力的推動(dòng)作用[16-18]。嗜鉻細(xì)胞瘤是起源于腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞，以分泌大量?jī)翰璺影返暮币?jiàn)腫瘤，可引起陣發(fā)性或持續(xù)性高血壓，繼發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的損害[13]。嗜鉻細(xì)胞瘤引起的高血壓性腦出血是神經(jīng)系統(tǒng)損害的表現(xiàn)之一。經(jīng)過(guò)手術(shù)治療后，大部分患者可以獲得較好的預(yù)后。嗜鉻細(xì)胞瘤的細(xì)胞大量分泌兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)如腎上腺素、去甲腎上腺素及多巴胺。這些物質(zhì)在兒茶酚胺-O-甲氧基轉(zhuǎn)移酶的作用下生成甲氧基腎上腺素類(lèi)物質(zhì)（MNs）[11]。游離型MNs經(jīng)過(guò)腫瘤細(xì)胞分泌，慢慢滲漏進(jìn)入血液循環(huán)。因此，嗜鉻細(xì)胞瘤的診斷應(yīng)該測(cè)定血漿和24 h尿液中兒茶酚胺及其代謝物，包括E、NE、MN和NMN含量。但是，一些藥物如對(duì)乙酰氨基酚、兒茶酚胺類(lèi)和左旋多巴等藥物可以影響兒茶酚胺類(lèi)及其代謝物含量檢測(cè)，需要告知患者避免使用該類(lèi)藥物，或者停用2周后，再檢測(cè)，避免假陽(yáng)性[19-21]。

本研究采用HPLC-ECD法，以30名正常健康人的血漿腎上腺素、去甲腎上腺素及代謝物甲氧基去甲腎上腺素、甲氧基腎上腺素的含量測(cè)定統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)為指標(biāo)，2例確診為嗜鉻細(xì)胞瘤患者、18名正常人、確診的2例嗜鉻細(xì)胞瘤患者的NE和NMN遠(yuǎn)高于正常健康患者，其余18名家屬中檢測(cè)值在正常健康成人的范圍，其他2名比正常值高，建議去醫(yī)院進(jìn)一步檢查。本研究對(duì)嗜鉻細(xì)胞瘤診斷、鑒別診斷和預(yù)后，有較好的臨床意義。

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（收稿日期：2018-06-27? 本文編輯：王? ?蕾）