細菌源追蹤技術在楊家河水域枯水期的應用

李正潔，程漢超

（山東省環境保護科學研究設計院有限公司，濟南250012）

1 引言

本研究選取南四湖流域光府河支流楊家河段為研究對象。對研究對象枯水期進行取樣和分析，研究水體中大腸桿菌種類與周邊污染物的關系。

2 樣品采集

已知源樣的采集：采樣選擇在光府河支流楊家河周邊的王橋村、孫橋村和南營村，在村內采樣優先采取污染貢獻率比較大的采樣點，如養鴨場和養豬場，然后依次安排，村內采樣具體地點選擇隨機分散。

水樣的采集：在楊家河王橋段和楊家河橋段沿河流走向采集水樣，采集水樣20份。

3 實驗部分

3.1 人和動物糞便樣本中大腸桿菌的分離

糞便樣本直接劃線接種伊紅美藍瓊脂平板36℃培養24h，每個樣本挑取3個深紫黑色、具有金屬光澤，且革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌的菌落，轉種于TSA上36℃培養24h，然后使用Vitek 2 Compact鑒定系統進行鑒定，凡鑒定為大腸桿菌陽性者，保存于磁珠凍存管中（-80℃）。

3.2 脈沖場凝膠電泳（PFG E）分型試驗

從檢測培養基上挑取單菌落，接種于TSA平板上培養，37℃孵育箱培養14h；用同一個接種針/環，穿刺或接種于小螺帽管中的TSA培養基，以保證必要時重復檢測同一個克隆。同時接種標準株H9812，依次進行細菌包埋、細菌裂解、清洗膠塊、膠塊內DNA的酶切、加樣、電泳、圖像獲取、圖像分析。

3.3 水中總大腸菌群的測定和大腸桿菌的分離

取10mL水樣接種到10mL雙料乳糖蛋白胨培養液中，然后取1mL水樣接種到10mL單料乳糖蛋白胨培養液中，另取1mL水樣注入9mL生理鹽水中，混勻后吸取1mL（即0.1 mL水樣）注入10mL單料乳糖蛋白胨培養液中，每一稀釋度5管。

將接種管置36℃培養箱中，培養24h，如計數產酸產氣管數，將產酸產氣管分別接種到2個伊紅美藍瓊脂平板上36℃培養24h，觀察菌落形態，挑取符合深紫黑色、具有金屬光澤的菌落，紫黑色、不帶或略帶金屬光澤的菌落或淡紫紅色、中心較深的菌落作革蘭氏染色實驗，若革蘭氏染色陰性無芽胞桿菌的則進一步接種單料乳糖蛋白胨培養液36℃培養24h，復發酵。以上試驗全部陽性者記錄為陽性管數，查MPN（最大可能數）檢索表，記錄100mL水樣中的總大腸菌群MPN值。

挑取上文所述伊紅美藍瓊脂平板生長的深紫黑色、具有金屬光澤，且革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌的菌落，轉種于TSA上36℃培養24h，每份水樣隨機挑取2支陽性發酵管對應平板，挑取3個菌落，使用Vitek 2 Compact鑒定系統進行鑒定，凡鑒定為大腸桿菌陽性者保存于磁珠凍存管中（-80℃）。

3.4 脈沖場凝膠電泳（PFG E）分型試驗

水中大腸桿菌脈沖場凝膠電泳分型試驗與人及動物糞便樣本中大腸桿菌的分型試驗操作程序相同。

4 結果和討論

4.1 樣本采集結果

枯水期采集水樣20份，采集人及動物糞便樣本24份，具體采樣情況如表1所示。

表1 樣本采集情況

4.2 水中總大腸菌群的測定結果

枯水期水樣中檢測到總大腸菌群的存在，具體結果如表2所示，表明該流域水樣均受到了人或動物糞便的污染。

4.3 枯水期PFG E分型結果

通過對枯水期水樣的分型結果進行分析可知，枯水期楊家河水體的污染源為鴨源53.3%，豬源30.0%，人源1.7%，未知源的為15%。

表2 水體總大腸菌群測定結果

4.4 討論

本次試驗人和動物糞便選取楊家河周邊的王橋村、孫橋村和南營村，采集鴨糞便10份、豬糞便10份、人糞便4份。水樣采取選取洸府河支流楊家河王橋段和楊家河橋段，采集水樣20份。

通過PFGE分型結果發現：

1）枯水期水樣中檢測到總大腸菌群的存在，每100ml水樣中總大腸菌群MPN值為在79～920，表明該流域水樣均受到了人或動物糞便的污染。枯水期20個水樣中，僅3個水樣中總大腸菌群數滿足GB 3838—2002《地表水環境質量標準》II類標準（≤2000個/L）要求。14個水樣中的總大腸菌群超過了GB 3838—2002《地表水環境質量標準》II類標準（≤2000個/L）要求，但滿足III類標準要求，有4個水樣中總大腸菌群數達到9200個/L，接近于10000個/L標準。有3個水樣中總大腸菌群數量高達1.6×104個/L，僅滿足GB 3838—2002《地表水環境質量標準》IV類標準（≤2000個/L）要求。

2）枯水期的楊家河水體的污染源為鴨源53.3%，豬源30.0%，人源1.7%，未知源的為15%。

現場調查發現，楊家河段河流兩側有數家養豬場、養鴨場，養殖場存在糞便隨意堆放、污水直接排放的現象，沒有經過統一收集和集中處理，尤其有2家養鴨場，距楊家河較近，糞便極易通過雨水進入水體，污染環境，與PFGE分型結果中鴨源占比較高一致。

5 結論

利用細菌源追蹤技術對南四湖水域洸府河支流楊家河段水體細菌源進行鑒別、評估，將非點源污染控制轉化為點源污染控制，為山東省水資源保護、監督管理提供了科學依據和技術支持，在山東省乃至全國的水資源保護中都將起到示范作用。