三峽水庫水域牧場鰱放流后對環境的生理適應

英士娟，陶怡曦，胡穎雄，楊 帆，段必成，王軍紅，李 云

(1.西南大學動物科技學院，重慶三峽生態漁業產業技術研究院，重慶 400715；2.西南大學淡水魚類資源與生殖發育教育部重點實驗室，重慶 400715；3.三峽工程魚類資源保護湖北省重點實驗室，中國三峽集團中華鱘研究所，湖北宜昌 443100)

由于長江水利工程的建設和漁業資源的過度捕撈，長江流域野生魚類數量急劇下降[1]。為緩解漁業資源下降的趨勢，我國廣泛開展了水生生物增殖放流工作。但是人工養殖的魚苗或魚種投放到天然水體中，由于生存環境的改變，會導致魚類產生氧化應激反應，極大地影響硬骨魚類的生理和行為[2]。應激反應具有兩面性，適當應激可以增加機體免疫力，過度應激則會導致應激反應超過機體自我調節閾值，打破了機體生理平衡，使機體免疫力降低甚至死亡[3-5]。因此，研究魚類放流后的生理適應過程，對天然水域魚類資源增殖、養護具有重要指導意義。目前關于魚類增殖放流的效果評估報道主要集中在存活率和生長速率方面[6-8]，曹偵等[9]研究發現長江流域放流的中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)約70天時生理狀況接近放流前水平，表明水生動物對環境改變的適應能力因種而異。

鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)是我國四大家魚之一，也是長江增殖放流最主要的魚類，在三峽庫區天然水域放流濾食性鰱，既可保護其種質資源，又能通過食物鏈吸納營養鹽改善水質[10]，因此，本研究以三峽水庫水域牧場放流鰱為實驗對象，通過測定其放流前后肝胰臟和血清生理生化指標變化，了解鰱放流后對環境變化的生理適應過程，對提高鰱增殖放流效果具有指導作用，也可為其他魚類的增殖養護提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料來源及樣品采集

實驗用魚來自重慶市北碚區歇馬養殖場人工繁育的鰱大規格苗種。選取規格均一，健康無傷的鰱110尾，體長為(28.63±1.91)cm，體重為(440.91±82.74)g。實驗時間為2014年10月13日至2014年12月20日。放流前0天的鰱15尾作為對照組，在養殖場取樣。放流地點為重慶市三峽生態漁業股份有限公司所屬忠縣水域牧場，該場位于甘井河與長江干流形成的河口庫灣，面積約400公頃，平均水深40 m，采用攔網的方式實施人工放養鰱、鳙魚種。為開展實驗，在主河道建設了4個原位竹網箱，網箱規格為5 m×5 m×3 m。將110尾實驗鰱平均放到4個網箱中。取樣時間為放流后第5、10、14、28、60和68天。每次取樣時測量水溫、溶解氧(DO)和pH等參數(表1)，并隨機抽取鰱15尾，取樣前用150 mg/L的MS-222麻醉實驗魚，快速測量體長、體重，然后置于解剖盤中迅速用一次性注射器從尾部靜脈端抽取血液2 mL，4 ℃靜置2 h，凝固后3 500 r/min、4 ℃離心15 min，取上清液制備血清，放置于-80 ℃冰箱保存。同時解剖取其肝胰臟組織，經超純水清洗后置于凍存管中于-80 ℃冰箱保存。

表1 鰱樣本和采樣水體條件參數Tab.1 The parameters of samples and water

1.2 指標測定方法

選用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定放流前后鰱肝胰臟中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)的活性，根據試劑盒操作步驟進行測定。選用日本奧林巴斯Au 400全自動生化分析儀測定血清中谷丙轉氨酶(ALT)、谷草轉氨酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、乳酸脫氫酶(LDH)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、總膽紅素(TBIL)、總蛋白(TP)放流前后的活性或含量，根據儀器操作規范和配套試劑盒操作步驟進行操作。

1.3 數據分析

實驗數據采用SPSS 18.0統計分析軟件進行單因素方差分析，以平均值±標準誤(mean±SE)的方式表示，用LSD檢驗法和Dunnett’s檢驗法進行組間檢驗，P<0.05則差異顯著。

2 結果

2.1 放流后鰱血清乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷丙轉氨酶、谷草轉氨酶活性的變化

放流后鰱血清的LDH、ALP、ALT 和AST 活性都呈現先升高再降低的趨勢(表2)。在第5天均達到最高值，且都顯著高于放流前水平。LDH、ALP、ALT 和AST 最高值分別為(752.71±102.39)、(13.75±2.31)、(45.76±2.37)、(137.52±10.98) U/L，5 d后逐漸降低，分別在第10天后達到穩定水平。

表2 放流后鰱血清中乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶和轉氨酶活性變化Tab.2 The activity changes of LDH， ALP， ALT， AST in H. molitrix after stocking

2.2 放流后鰱血清總蛋白、甘油三酯、總膽固醇和總膽紅素的變化

放流后鰱血清中TP、TG、TC 和TBIL 都出現了不同程度的先升高后下降的變化(表3)。其中TP 、TG和 TBIL在第5天達到了最高值，最高值分別為(26.53±0.37) g/L、(1.21±0.06) mmol/L和(2.00±0.09) μmol/L，TC 在第10天時達到了最高值(4.54±0.11) mmol/L，顯著高于放流前水平，5 d后活性逐漸下降。68 d時TP和TBIL恢復至原水平，但TG顯著低于放流前水平，TC顯著高于放流前水平。

表3 放流后鰱血清總蛋白、甘油三酯、總膽固醇和總膽紅素的變化Tab.3 The changes of TP， TG， TC， TBIL in H. molitrix after stocking

2.3 放流后鰱肝胰臟中抗氧化酶活性變化

放流后鰱肝胰臟中SOD 和CAT 都呈現先升高再降低的趨勢，在14 d時都達到了最高值，最高值分別為(10.13±0.09)、(88.90±17.77) U/mg prot，且均顯著高于放流前水平，之后逐漸降低，其中SOD 在68 d時恢復到原有水平，CAT 在60 d時與放流前無顯著差異，但略高于放流前水平(表4)。

表4 放流后鰱肝胰臟中抗氧化酶活性變化Tab.4 The changes of SOD and CAT in H. molitrix pancreas after stocking

3 討論

3.1 放流對鰱血清乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、轉氨酶活性和總膽紅素的影響

LDH是糖代謝中催化丙酮酸轉化為乳酸的酶，正常條件下血清LDH含量遠低于組織中LDH含量[11]。ALP主要來源于肝胰臟，可催化磷酸單酯及磷酸核苷等類似化合物水解，同時還能參與體內蛋白質合成和脂質代謝等[12]，可反映機體代謝程度，是肝胰臟損傷的重要指示酶。AST和ALT是肝胰臟代謝過程中指示肝胰臟損傷的重要酶，機體正常代謝環境下只有少量轉氨酶因細胞的不斷更新、破壞而釋放到血液中，血清中含量相對較低[13]。其活性高低可以判斷肝胰臟損傷程度，常作為機體肝損傷的指標[14]。熱應激下虹鱒血清中AST和ALT的活性升高，由此判斷熱應激導致虹鱒肝胰臟損傷[4]。肝胰臟損傷時，細胞膜的通透性加大，使組織中LDH、ALP、AST和ALT釋放到血液中，血清LDH、ALP、AST和ALT的活性短時間內急劇升高[15]，影響機體的正常代謝活動。本研究中第5天鰱血清中LDH、ALP、AST和ALT均達到最高值，這可能是放流后受到環境因子的脅迫導致肝胰臟組織細胞受到損傷，影響了肝胰臟的正常生理功能，機體中脂質過氧化物增多所致。隨時間的延長其活性逐漸回降至原水平，表明放流鰱對環境快速適應，肝胰臟損傷得以恢復。

TBIL是二甲川膽色素屬的一種膽汁色素，血液中含有直接型和間接型兩種膽紅素，前者主要來自肝細胞中非血紅蛋白血紅素的分解，后者主要來自紅細胞破壞降解或衰老的紅細胞崩解[16]。實驗初期鰱體內膽紅素的含量顯著升高，可能是由于放流后生理應激，導致肝細胞異常，肝功能減退，肝胰臟中間接膽紅素轉化為直接膽紅素的能力減弱，同時直接膽紅素排泄受阻，不能完全排到膽道，使得血清中膽紅素的含量升高，這與斜帶石斑魚和虹鱒溫度脅迫后的TBIL變化趨勢一致[17-18]。實驗后期總膽紅素的含量逐漸降低至放流前水平，說明鰱的肝胰臟功能逐漸恢復。

3.2 放流對鰱血清總蛋白、甘油三酯和總膽固醇的影響

血清中的白蛋白和球蛋白合稱為TP，是組織蛋白合成的原料，反映機體蛋白代謝狀況，在魚的肝胰臟中合成，可修復機體組織，反映魚體的非特異性免疫水平的高低，還可作為能源物質緊急供能，是衡量魚類應激水平的指標之一[19-20]。本研究中放流初期鰱血清TP的含量快速升高，放流后5 d達到峰值，其原因可能是放流初期對環境變化應激反應所致，之后顯著下降，28 d后趨于穩定，表明放流魚類生理狀態逐漸趨于穩定。

TG和TC是血脂的主要成分，參與機體基礎代謝。TG來自食物中的脂肪，肝胰臟也可以將某些糖類轉化為TG，是動物脂肪的主要成分，是被儲藏的可迅速參與生命活動的高效能源[17]，可反映機體肝代謝功能。當機體處于應激狀態時，會加強脂肪和肌肉組織的脂肪動員和肝糖異生活動，導致機體游離脂肪酸和血糖水平升高[21]，實驗中鰱血清TG的含量在放流初期升高，說明此時機體肝胰臟脂肪代謝受到顯著影響。在實驗后期TG的含量逐漸下降并穩定在較放流前稍低的水平，其原因一方面可能是鰱放流到天然水體產生應激反應后的回降，另一方面可能是鰱從放流前充足的人工投喂轉變到季節性水溫下降導致天然餌料不足而處于半饑餓狀態[22]，機體脂肪消耗減少所致。實驗過程中放流后鰱血清10 d內TC的含量處于持續升高狀態，可能是由于氧化應激反應使肝胰臟損傷導致膽固醇的代謝途徑受阻，代謝物質積累。10 d后TC含量逐漸回降，表明鰱肝胰臟功能逐漸恢復。

3.3 放流對鰱肝胰臟抗氧化酶活性的影響

任何生物體中均含有一定量自由基，其中活性氧(ROS)是生物體最重要的自由基，正常代謝過程中活性氧發揮著重要的生理作用，當機體處于氧化應激狀態時，ROS的數量大量增加，打破了機體ROS代謝平衡，對脂肪、蛋白質和核酸等造成一定的損傷[23]。肝胰臟中CAT和SOD是直接參與分解體內ROS的主要抗氧化酶。SOD可以將O2-歧化為H2O2和O2，而CAT可以將H2O2催化分解為H2O和O2。機體內CAT和SOD的活性變化通常說明機體內積累了過量的ROS[24]。結果顯示，在鰱放流后，肝胰臟中SOD和CAT活性都有升高，在14 d時都達到了最高值，說明放流初期機體產生大量的抗氧化酶以清除體內過量的ROS，防御過氧化損害[25]。14 d后抗氧化酶活性逐漸回降，其中SOD在68 d時恢復到原有水平，CAT活性在60 d時與放流前無顯著差異，表明放流14 d后，隨著氧自由基的清除，環境脅迫效應逐漸減弱，鰱逐漸適應了新的環境。

4 結論

本研究測定了人工養殖鰱放流至天然水體后血清和肝胰臟生理生化指標的變化。結果表明，放流初期，由于環境變化，使鰱產生了較強的應激反應，表現為放流后5 d反應肝胰臟功能的血清酶活性和代謝指標升高，表明肝胰臟組織應激損傷，代謝加強應對應激所需，在5～14 d后各項指標逐漸下降最后恢復到放流前水平或者達成新的穩態。另一方面肝臟組織主要的抗氧化酶活力在放流后14 d升高到峰值，抗氧化能力增強以消除應激產生的ROS，在60～68 d接近放流前水平。放流后68 d多數指標已達到穩定狀態或達到新的平衡，表明鰱從人工養殖環境轉換到 d然水域至少需要68 d的生理適應期。以上研究結果對闡明放流鰱對天然水域的生理適應過程提供了基礎數據，可為深入研究鰱對環境脅迫的生理響應機制提供參考。結果提示，對魚類放流前有必要進行野化訓練，放流后要進行一段時間的監管，以便其順利地渡過環境應激適應期，對提高魚類的野外存活率和放流效果具有重要意義。