海南地區魚蝦混養模式下密度對羅非魚的生長、代謝和免疫的影響

肖 煒，李大宇，鄒芝英，祝璟琳，李芳遠，佟延南，王德強，楊 弘

(1.中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業部淡水魚類遺傳育種和養殖生物學重點開放實驗室，江蘇無錫214081；2.海南省海洋與漁業科學院，海口 570100)

養殖密度是影響魚類生長速度、養殖產量和效益的主要因素之一。近年來隨著水產養殖集約化水平的提高，魚類等水產動物放養密度不斷上升，單位水體的生產量顯著提升，經濟效益增加明顯[1]。然而，水產養殖密度的上升會引起魚類對資源的競爭加劇，魚類生理水平發生變化，因此過高的養殖密度可能導致魚類生長、代謝及免疫水平的變化，致使魚類用于生長的能量減少，對生產效益產生影響[2，3]。此外，過高的養殖密度也會給養殖水環境帶來一定的破壞[4]，因此尋找魚類合適的養殖密度是目前水產養殖研究的重要方向。

吉富羅非魚(GIFT，Oreochromisniloticus)是聯合國糧農組織向全世界推廣養殖的優良品種，具有生長快、食性雜、無肌間刺等諸多優點，深受各國水產養殖業者的歡迎，也是我國的主要養殖魚類之一。然而隨著人工成本 、飼料價格、池塘租金的逐步上升，羅非魚養殖成本逐年增加，而商品魚受市場各類因素影響，價格持續下跌，羅非魚養殖經濟效益逐年下降。羅非魚混養經濟價值較高的南美白對蝦的模式，可以提高羅非魚餌料利用率，降低池塘內代謝物積累，而且羅非魚可以攝食病蝦，有效減少對蝦病害發生率，提高養殖效益[5]。目前，該混養模式下的羅非魚最適養殖密度研究還存在空缺，因此有必要對現有的魚蝦混養模式進行優化，進一步提升養殖效益并促進產業可持續發展。本研究對以羅非魚為主養對象的魚蝦混養模式下不同放養密度羅非魚的生長、代謝和非特異性免疫指標開展跟蹤分析，旨在確定該模式下羅非魚的最佳養殖密度，為以羅非魚作為主養對象的魚蝦混養模式提供生產指導。

1 材料與方法

1.1 實驗魚養殖

試驗在海口三江灣養殖基地開展，試驗池塘為堤鋪地膜的對蝦養殖池塘，共3口，每口池塘面積3 335 m2，塘深2.0 m，水深1.5 m，塘底有少量淤泥，進排水系統完全，從三江灣入海口取水，水源充沛，水體鹽度0.5%，每口池塘配置1臺3.0 kW的羅茨增氧機，底部微孔增氧，保持溶解氧在6.0 mg/L以上。5月底分別放養吉富羅非魚苗(0.65 g/尾)和凡納濱對蝦苗(2.5～3.0 cm)，3口池塘羅非魚放養密度分別為6 000、8 000、10 000尾/667 m2；對蝦苗養殖采用輪捕輪放的方式，每次每口池塘投放5 000尾，共投放3次。試驗期間按投放羅非魚的尾數投喂同等質量的羅非魚飼料，分別在8∶00～9∶00和17∶00～18∶00利用投餌機進行飼料投喂，飼料投喂量和投喂頻率視羅非魚生長情況、天氣、魚類活動情況進行調整。定期潑灑益生菌改善水質， pH維持在8.0～8.5。

1.2 樣品采集及測量

經過150 d養殖后，停止投喂24 h，各池塘隨機捕撈羅非魚100尾，投入100 mg/L的MS-222 中進行麻醉，分別用電子天平和直尺測量體重(BW)和體長(BL)，每個池塘隨機選取15 尾魚，尾靜脈采血，4 ℃下5 000g/min離心5 min，吸取上層血清，使用邁瑞BS-600 全自動生化分析儀進行分析測定甘油三脂(TG) 、總膽固醇(TC)、葡萄糖(GLU)、谷丙轉氨酶(ALT) 、谷草轉氨酶(AST) 、堿性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)等生理生化指標。同時，每口池取9尾魚，解剖并取50 mg左右肝臟凍存于液氮中，用于免疫相關基因表達量檢測。

按以下公式計算增重率(WGR)、特定生長率(SGR)和肥滿度(CF) 。

增重率(WGR)=(Wt-W0)/W0×100%

特定生長率(SGR)= (lnWt-lnW0)/t×100%

肥滿度(CF)=100×Wt/L3

其中W0為初始魚體重(g)，Wt為實驗末魚體重(g)，Lt為實驗末魚體長(cm)，t為養殖天數。

1.3 cDNA的合成與Real-time PCR

肝臟樣品在液氮中研磨后，用Trizol法提取總RNA，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測完整性，并用NanoDrop Lite (Thermo Scientific， USA)分別測定樣品總RNA濃度和質量。取1 μg 肝臟RNA使用PrimeScriptTMRT試劑盒(TaKaRa)將mRNA進行逆轉錄成cDNA。以β-actin為內參基因，設計候選基因C型溶菌酶C-LZM、腫瘤壞死因子TNF-α、細胞白介素IL-1β的引物，所有基因的引物序列見表1。引物序列均由上海生工生物科技有限公司合成。以cDNA為模板，在ABI 7900 HT實時熒光定量PCR儀(ABI， USA)中進行熒光定量PCR。反應體系為20 μL: SYBRGreen Realtime PCR Master Mix(Toyobo)10 μL，目的基因上下游引物各1.6 μL，cDNA模板 1 μL，RNase Free Water 5.8 μL，單樣品重復3 次。PCR反應程序為：95 ℃預變性2 min 20 s；95 ℃ 15 s、59～61 ℃ 60 s，循環數為40。

表1 免疫基因的引物序列及其退火溫度Tab.1 Immune functional gene primers sequences and annealing temperature

1.4 數據處理與分析

實時熒光定量PCR的數據處理采用2-ΔΔCt法進行計算(ΔΔCt=ΔCt目的基因-ΔCt內參基因)。所有數據分析結果使用 SPSS 19.0統計軟件進行單因素方差分析(One-Way ANOVA)， 當結果達到顯著差異(P<0.05)時，采用Tukey’s檢驗進行多重比較，數據用Mean±SD表示。

2 結果與分析

2.1 養殖密度對羅非魚生長性能的影響

經過150 d養殖后羅非魚增重率(WG)分別為71 194%、69 285%和49 977%，特定生長率(SGR)分別為4.37%/d、4.36%/d和4.14%/d。池塘的養殖密度對羅非魚生長有顯著性影響，10 000尾/667 m2密度下羅非魚增重率和特定生長速率顯著低于6 000尾/667 m2和8 000尾/667 m2密度下養殖的羅非魚，此外6 000尾/667 m2密度下的羅非魚增重率和特定生長速率略高于8 000尾/667 m2密度下的羅非魚，但兩者差異不顯著。3個不同養殖密度對羅非魚肥滿度(CF)無顯著影響。此外，三個密度下分別收獲(10～12.5 g)規格的對蝦165、159、151 kg，對蝦產量隨著羅非魚養殖密度的上升呈現緩慢下降的趨勢。

表2 不同養殖密度對羅非魚生長性能的影響Tab.2 Growth performance of tilapia reared at different stocking densities

2.2 養殖密度對羅非魚代謝和免疫的影響

血清葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇等代謝指標受養殖密度影響顯著，其中10 000尾/667 m2密度下羅非魚血清中葡萄糖、甘油三脂和總膽固醇濃度均低于6 000尾/667 m2和8 000尾/667 m2密度下養殖的羅非魚；而谷草轉氨酶、谷丙轉氨酶含量則呈現相反的趨勢，10 000尾/667 m2密度下羅非魚血清中兩者的含量顯著高于養殖密度為6 000和8 000尾/667 m2池塘的羅非魚。血清中堿性磷酸酶和超氧化物歧化酶在3個養殖密度的羅非魚體中無顯著性差異。

表3 不同養殖密度對羅非魚血清代謝及免疫指標的影響Tab.3 The levels of serum metabolism and immune parameters of tilapia reared at different stocking densities

由圖1可知，不同養殖密度對羅非魚的免疫相關基因表達有顯著性影響，其中C-LZM隨著養殖密度的上升 顯著性下降，10 000尾/667 m2密度下羅非魚肝臟的C-LZM表達量顯著低于養殖密度為6 000 m2和8 000 尾/667 m2池塘的羅非魚。而IL-1β、TNF-α則與之相反，IL-1β方面，6 000 尾/667 m2密度下羅非魚肝臟表達水平顯著低于8 000和10 000 尾/667 m2養殖密度；TNF-α方面，6 000和8 000尾/667 m2密度下羅非魚肝臟表達水平顯著低于10 000 尾/667 m2。

圖1 不同養殖密度對羅非魚肝臟相關免疫基因的表達水平Fig.1 Hepatic immune functional gene transcripts of tilapia reared at different stocking densities

3 討論

養殖密度是影響水產養殖生產力和養殖效益的重要因素，而魚類生長性能是評價養殖密度優劣的重要指標[6，7]。目前對羅非魚在傳統的粗放的養殖管理模式下的最佳養殖密度在1 500～2 500 尾/667 m2之間[8]。而隨著現代化養殖設施的應用，我國羅非魚養殖技術和管理水平不斷獲得提高，羅非魚集約化養殖可以突破5 000 尾/667 m2以上的密度。然而由于水體的容量關系該模式下羅非魚合理養殖密度有一定的上限，不合理的提升養殖密度容易造成擁擠脅迫，進而降低餌料系數和生長速率[9，10]；同時，高密度更易導致魚類排泄物積累，致使導致養殖水體中氨氮、溶解氧、浮游生物等理化和生物因素產生劇烈變化，對羅非魚代謝、免疫水平帶來負面影響[11]。因此，特定養殖條件和管理條件，均有相對應的適宜養殖密度。研究結果顯示密度為6 000、8 000 尾/667 m2羅非魚生長速率差異不顯著，而10 000 尾/667 m2的密度下羅非魚生長速率顯著低于6 000和8 000 尾/667 m2，過低的養殖密度易導致養殖效益下降，該養殖模式下養殖密度上限保持在8 000 尾/667 m2較為合適。

血液作為魚類重要的組織之一，其生理指標變化與機體的新陳代謝、生理狀況有密切關系，因而可用來評價魚體的健康狀況及其對環境的適應[12，13]。強俊等[14]在室內對吉富羅非魚急性脅迫實驗顯示隨著擁擠脅迫時間的增加，羅非魚血清GLU和TG水平呈逐漸下降的趨勢。在本研究中，養殖羅非魚的血清葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)均受到養殖密度的影響，隨著養殖密度的上升而逐漸下降，這可能歸因于羅非魚在較高密度下的長期脅迫下，維持羅非魚的健康生長需要更多的能量消耗，GLU作為第一類供能物質，必然處于較低的水平，同時GLU一旦消耗過大必然調動TG和TC類物質開展分解代謝，維持血清中的GLU濃度在合理水平。血清中ALT和AST作為魚類氨基酸代謝的重要標記酶，在生物體內催化α-氨基酸的α-氨基與α-酮基進行轉換，其活性變化可指示魚類受到脅迫或肝臟應激反應等[15，16]。本研究中羅非魚在10 000 尾/667 m2密度養殖下ALT和AST的活性均顯著高于6 000和8 000 尾/667 m2密度，說明10 000 尾/667 m2高密度養殖下羅非魚體內的氨基酸代謝處于偏離正常水平的應激狀態，通過更多地降解氨基酸來應對環境脅迫，導致ALT和AST的活性上升。

本研究中10 000 尾/667 m2密度下養殖羅非魚肝臟的C-LZM表達量顯著低于養殖密度為6 000～8 000 尾/667 m2的羅非魚，這可能是因為長期擁擠脅迫下羅非魚肝臟免疫機能受損，導致C-LZM基因表達顯著性下降。而C-LZM是一種參與細胞抵御外界病害侵襲的免疫蛋白，能夠抑制體內細菌繁殖，在機體防御過程中起著關鍵作用[17-19]。同時，腫瘤壞死因子TNF-α和細胞白介素IL-1β屬于促炎性細胞因子，在炎癥信號級聯中，TNF-α通常與下游IL-1β基因表達上調[20]。研究發現10 000 尾/667 m2密度下養殖羅非魚肝臟IL-1β和TNF-α表達量顯著高于6 000 尾/667 m2，這可能是因為過高的養殖密度促進體內IL-1β和TNF-α等促炎性細胞因子表達上調，促使羅非魚長期處于應激狀態。相關研究發現高密度養殖下草魚[21]、塞內加爾舌鰨[22]等也出現類似的免疫應激變化，與本研究結果相互驗證。

綜合以上，在當前混養模式下建議羅非魚養殖密度不高于8 000 尾/667 m2。