投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚生長和肝臟健康的影響

劉 偉， 文 華， 蔣 明， 吳建軍， 吳 凡， 田 娟， 陸 星，喻麗娟

(1.中國水產科學研究院長江水產研究所，農業農村部淡水生物多樣性保護重點實驗室， 武漢 430223；2.武漢新華揚生物科技有限公司， 武漢 430074)

投飼技術是魚類養殖成功與否的關鍵因素。投飼技術包括投喂率、投喂頻率、投喂節律和投喂地點等。其中，投喂率和投喂頻率對魚類的生長和飼料利用效率影響最為顯著[1]。一般認為，適宜的投喂頻率可以促進魚類的生長，降低魚類個體分化，提高存活率和飼料利用率，減少殘餌和代謝廢物排放對養殖環境的污染[2]。適宜的投喂率在最大限度滿足魚類正常生長的同時也可以節約飼料成本[3]。同時，投喂率[4]和投喂頻率[5]也會對魚類健康產生影響。因此，尋求最佳的投喂率和投喂頻率是水產養殖成功的關鍵環節之一。

羅非魚是聯合國糧農組織(FAO)向全世界推廣的優良水產養殖對象。自2011年以來，我國的養殖產量一直穩定在140萬噸以上，位居世界首位。研究發現，羅非魚的投喂率或投喂頻率隨體重的增加而降低[6-8]。但是，受到實驗環境、飼料質量、養殖品種或品系等因素的影響，即使相同規格的羅非魚，其適宜投喂率或投喂頻率的研究結果差異明顯。如在封閉循環系統中養殖的初始體重60 g的奧利亞羅非魚(Oreochromiscoaureus)，其最適投喂率僅為2%[9]，而在水泥池網箱中養殖的初始體重72 g的吉富羅非魚(GIFT，Oreochromisniloticus)，其投喂率可達6.21%[10]。早期推薦適宜水溫下5～25 g的羅非魚，最佳投喂率為4%，最佳投喂頻率為4次/d[11]；但最近對體重5～16 g的吉富羅非魚的研究則發現，最佳投喂率為6%，最適投喂頻率為2次/d[7]。此外，有關投喂率和投喂頻率對羅非魚生理健康影響方面的研究報道也較少。吉富羅非魚是經過遺傳性狀改良后的尼羅羅非魚，其生長速度較其他品系快5%～20%[12]，是我國羅非魚養殖中主要養殖品系之一，其養殖面積曾占我國羅非魚養殖面積的60%以上[13]。因此，本研究以吉富羅非魚為研究對象，通過研究不同投喂率和投喂頻率對其生長、飼料利用、體成分、肝臟組織學結構和部分生理生化指標的影響，探討投飼技術對羅非魚生長和健康的影響，以期為羅非魚飼料的合理使用提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 實驗飼料

以豆粕、菜粕、魚粉等為原料，配制成蛋白水平為33.5%，脂肪水平為6.9%的實用配方飼料(配方見表1)。將各種原料粉碎，過60目篩，按飼料配方稱重后充分混勻，利用小型絞肉機制成直徑為2 mm 的成品飼料，自然風干，破碎后，置于- 20℃冰箱中儲藏備用。

1.2 實驗魚

實驗魚來源于湖北省羅非魚原良種場。運回后，暫養在4個直徑1 m (有效容積400 L)的循環水養殖系統中，使實驗魚恢復體質，并適應養殖環境。暫養期間每天表觀飽食投喂2次(8∶30和16∶30)實驗飼料。2周后，選擇規格整齊，表觀健康的720尾魚，隨機分養于24個循環水養殖桶中(有效容積100 L)，每桶放魚30尾。實驗魚的平均體質量(3.78±0.01) g。

1.3 實驗設計和飼養管理

采用2×4雙因子實驗設計，共計8個處理組，每個處理組設置3個重復。依據資料[6，15-16]，本研究的投喂頻率(FF)設定為2次/d(8∶30和16∶30)和3次/d(8∶30，12∶30和16∶30)。在前期的馴養階段發現，實驗魚采用表觀飽食投喂，每天投喂2次，每次投喂15 min，通過計算可得每日的投喂率(FR)約為10%。據此，投喂率設定為8%，10%，12%和表觀飽食投喂。在投喂過程中，根據投喂頻率，平均分配每次的投喂量，每次投喂30 min。實驗持續30 d。每隔10 d稱重1次，以每個處理的平均體質量和成活率，并根據投喂率調整投喂量。養殖期間采用自然光照，水流2 L/(min·桶)，水溫(30.1±0.6) ℃，溶解氧>5 mg/L、氨氮濃度<0.5 mg/L、pH6.8～7.5。

表1 飼料配方及營養組成Tab.1 Formulation and nutrient composition of the diet

1.4 樣品制備、分析和指標計算

實驗開始20 d后，在羅非魚排便高峰期的20∶00～21∶00，用密網撈取并挑選條狀成型、飽滿的糞便，放入培養皿中，在-40 ℃的冰箱中冷凍后，放入真空冷凍干燥機中，冷凍干燥72 h。取出，粉碎過45目篩，放入樣品袋中，于-40 ℃的冰箱中保存。每天收集糞便1次，直至收集的糞便足夠分析為止。

實驗結束后，禁食24 h，麻醉(MS-222，150 mg/L)后，對每桶實驗魚進行計數和稱體質量。每桶隨機取魚3尾，測量體長和體質量，用于計算肥滿度；并于尾靜脈取血，混合后于4 ℃冰箱內靜置2 h，以3 000 r/min 的轉速離心15 min，得到空腹血清，保存于-80 ℃冰箱中，用于測定血清生化指標；隨后取肝臟、內臟并稱重，用于計算肝體比、臟體比；取同一部位的部分肝臟，放于4%多聚甲醛溶液中，用于檢測肝臟組織結構。去內臟全魚、肝臟和內臟分別保存于-20 ℃冰箱中，用于測定常規營養成分。另每桶隨機撈魚3尾，取其背鰭以下側線以上的肌肉，保存于-20 ℃冰箱中，用于測定常規營養成分。

測定方法：直接干燥法測定水分含量(GB/T 5009.3-2003)；凱氏定氮法測定粗蛋白質含量(GB/T5009.5 - 2003)；索氏抽提法測定粗脂肪含量(GB/T 5009.6- 2003) ；灼燒稱重法測定灰分含量(GB/T 5009.4- 2003)；電感耦合等離子質譜法測定Y2O3含量(GB/T 18115.1)。

使用日本希森美康(CHEMIX -800)全自動生化分析儀測定8種血清生化指標：總蛋白(TP)、球蛋白(ALB) 、堿性磷酸酶(ALP)、谷草轉氨酶(AST)、谷丙轉氨酶(ALT)、血糖(GLU)、甘油三酯(TGK) 和總膽固醇(TCHO)。

肝組織標本固定后石蠟包埋，連續切片，HE染色，光鏡下逐片觀察及照片，運用圖像分析軟件(Image Pro Plus 6.0)對HE染色結果進行處理。每塊組織隨機選擇4張照片進行分析。

其余各指標的計算公式如下：

增重率 (WG)=(W1-W0)/W0×100%；

特定生長率 (SGR)= (lnW1-lnW0)/t×100%；

飼料效率 (FE)= (Wf-Wi+Wd)/WA；

蛋白質效率 (PER)= (Wf-Wi+Wd)×100% /Wp；

成活率 (SR)=Nf/Ni×100%；

肥滿度 (CF)=W/L3×100；

肝體比 (HSI)=WH/W×100%；

臟體比 (VSI)=WV/W×100%；

飼料成本 (FC)=WA×F/ (Wf-Wi+Wd)；

干物質表觀消化率(AD)=100%×(1-Md/Mf)；

營養物質表觀消化率(ADCd)=100%×[1-(Nf/Nd) ×(Md/Mf)]。

式中，t為實驗天數(d)，W0和W1分別為實驗魚的初、末均體質量(g)，Wi、Wf和Wd、Wp分別為實驗魚的初、末總體質量(g)、死亡魚的體質量(g)和攝入飼料粗蛋白含量(g)，W為魚體質量(g)，L為魚體長(cm)，WA為投喂飼料總質量(g)，Ni和Nf分別為實驗結束后和開始時魚的尾數，WH、WV和W分別為肝胰臟、內臟質量和體質量(g)，F為配方成本(元/kg)，Md為飼料中標記物含量(%)，Mf為糞便中標記物含量(%)，Nd為飼料中營養成分的含量(%)，Nf為糞便中營養成分的含量(%)。

1.5 數據分析

2 結果

2.1 生長和飼料利用

投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚生長和飼料利用的影響見表2。由表2可見，投喂率和投喂頻率對實驗魚的平均末體質量、增重率(WG)、特定生長率(SGR)和肝體比存在顯著的交互作用。投喂率由8%增加到12%時，實驗魚的WG、SGR和飼料成本顯著升高。表觀飽食組實驗魚的WG和SGR顯著高于投喂率為8%的，而與其他組差異不顯著；但其飼料效率(FE)和蛋白質效率(PER)與投喂率為8%組的差異不顯著，顯著高于其他組。隨投喂率由8%增加到12%，飼料成本(FC)增加，實驗魚的成活率逐漸升高。投喂率為12%組的FC顯著高于其他組，表觀飽食投喂組的FC最低，但與8%和10%投喂率組的差異不顯著，而顯著低于12%投喂率組。投喂率和投喂頻率對實驗魚的肥滿度和臟體比無顯著影響，但對肝體比影響顯著。投喂率為8%組實驗魚的肝體比顯著小于投喂率為10%組的，而與其他組差異不顯著。由表2亦可見，投喂率和投喂頻率對實驗魚的表觀消化率的影響不顯著，但隨投喂頻率的增加，表觀消化率有改善的趨勢。

表2 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚生長和飼料利用的影響Tab.2 Effects of feeding frequency and feeding level on growth performance and feed utilization of GIFT tilapia

注：表中值為平均值±標準差(n=3)，同列數據肩標小寫字母不同，表示差異顯著(P<0.05)。APD，飼料粗蛋白表觀消化率。

2.2 體成分

投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚體成分的影響見表3。由表3 可見，僅發現投喂率對實驗魚的肝臟粗脂肪，以及去內臟全魚的水分和粗脂肪具有顯著影響；而投喂頻率對體成分無顯著影響。增加投喂率使得肝臟粗脂肪和去內臟全魚的粗脂肪含量增加，而去內臟全魚水分含量逐漸降低。表觀飽食投喂組實驗魚的肝臟粗脂肪和去內臟全魚水分含量與其他組差異不顯著，但其去內臟全魚粗脂肪含量顯著高于投喂率為8%組，而與其他組差異不顯著。

表3 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚體成分的影響Tab.4 Effects of feeding frequency and feeding level on body composition of GIFT tilapia% 濕重

2.3血清生化指標

投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚血清生化指標的影響見表4。由表4可見，投喂率對血清的谷草轉氨酶活性(AST)和血糖水平有顯著影響，而投喂頻率僅對血糖水平有顯著影響。10%投喂率組實驗魚的血清AST活性顯著高于投喂率8%組的。隨投喂率的增加，血糖水平逐漸增加，表觀飽食投喂組的血糖水平與10%和12%組差異不顯著，但顯著高于8%投喂組；隨投喂頻率的增加，血糖水平降低。投喂率和投喂頻率對血糖水平存在交互作用。

表4 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚血清生化指標的影響Tab.4 Effects of feeding frequency and feeding level on serum biochemical indexes of GIFT tilapia

2.6 肝臟組織結構

在本實驗中，各處理組實驗魚的肝細胞結構基本正常，細胞膜和細胞核清晰可見，所有處理組均發現有細胞核偏移和空泡現象，但未發現明顯的細胞膜溶解及炎癥細胞浸溶等病理現象。投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚肝組織形態的影響見表5。由表5可知，投喂率和投喂頻率對實驗魚肝細胞核的面積比例無顯著影響，但對其肝細胞空泡、細胞質面積比例有顯著影響。隨投喂率的增加，實驗魚肝臟空泡面積比例有增加的趨勢，表觀飽食組實驗魚的肝臟空泡面積最高，而細胞質面積最小。投喂率為8%，投喂頻率為2次/d實驗魚的肝細胞空泡和細胞質面積比例與表觀飽食投喂3次/d之間差異顯著。

表5 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚肝組織形態的影響Tab.5 Effects of feeding frequency and feeding level on liver structure of GIFT tilapia

3 討論

3.1 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚生長性能和飼料利用的影響

本實驗的結果發現表觀飽食投喂3次/d實驗魚的飼料效率最佳，但其生長性能與飼料成本均與投喂率為10%實驗魚的無顯著差異(表2)，表明以10%的投喂率，投喂 2次/d是適合吉富羅非魚幼魚生長的。在本實驗中，隨投喂率和投喂頻率的增加，實驗魚的生長性能得到提高，這與小丑魚(Amphiprionpercula)[17]、大蓋巨脂鯉(Colossomamacropomum)[18]的研究結果類似。但在8%～12%的投喂率下，投喂頻率未影響實驗魚的生長，這與已有羅非魚的研究類似[7，19]，表明羅非魚的生長依賴于食物的攝入量[2]。本實驗中，表觀飽食投喂3次/d具有較佳的生長性能和飼料利用效率，推測原因是每餐進行表觀飽食投喂，實驗魚每餐均可根據其生理需要保持最佳攝食量，從而更利于其生長并節約飼料。

隨投喂率由8%增加到12%，實驗魚的飼料效率逐漸降低，這與尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)的研究結果類似[20]，表明魚類的攝食量及消化吸收有一定限度，即存在一個最適和最經濟的投喂率，過高不但不會獲得最佳的生長速度，而且會造成飼料的浪費，增加養殖成本[3]。表觀飽食投喂組的飼料效率與投喂率為8%組的差異不顯著，但高于投喂率為10%和12%組，這與雜交斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus×I.furcatus)的研究結果類似[21]，表明表觀飽食投喂更利于飼料利用和節約成本。在本實驗中，實驗魚對飼料營養物質的表觀消化率未受投喂率和投喂頻率的影響，類似的研究結果在投喂率和投喂頻率對大西洋鮭(Salmosalar)的影響研究中也有所發現[22]。這可能與本實驗的投喂率與其最適生長所需的較為接近所致。Sajjadi[23]在對大西洋鮭(Salmosalar)適宜投喂率的研究中發現，與維持最大生長投喂率的實驗魚相比，相近的投喂率并未影響生長和營養物質的表觀消化率；同時，Xie等[24]也發現表觀飽食的尼羅羅非魚與相近的投喂量之實驗魚的生長，以及飼料粗蛋白、能量等的表觀消化率無顯著差異。

肝體比、臟體比和肥滿度是評價魚類營養生理狀況的常用指標[25]。本實驗中，投喂頻率3次/d實驗魚的肝體比顯著高于投喂2次/d的，且本實驗中投喂率為10%組實驗魚的肝體比顯著高于8%投喂率組的，這是因為肝臟作為魚類的營養物質代謝的主要器官，提高投喂率和投喂頻率增加了營養物質的積累[25]，造成了肝臟重量增加，進而肝體比提高。本實驗中，實驗魚在投喂率由8%升高至12%時的成活率有不顯著的升高，但是投喂率為8%的實驗魚的成活率顯著低于表觀飽食投喂組，這可能與低投喂率下，魚類的免疫力受到抑制，造成成活率偏低有關[26]。

一般來說，魚體成分中的脂肪和水分呈相反關系，蛋白質含量相對穩定[25]。本實驗中投喂頻率和投喂率對羅非魚肝臟、肌肉、去內臟全魚及內臟粗蛋白質含量均無顯著影響。但隨投喂率的增加，去內臟全魚和肝臟水分含量有降低趨勢，粗脂肪含量有升高趨勢，這與攝食量的增加，造成了能量物質的攝入增加，進而轉化成脂肪含量有關。

3.2 投喂率和投喂頻率對吉富羅非魚幼魚肝臟健康的影響

血液可以客觀反映養殖動物的營養代謝狀況，是重要的生理學、病理學和毒理學指標，對于研究機體新陳代謝和生理狀況具有重要意義[27]。當肝臟病變而引起細胞通透性增加，或受損傷的范圍較大時，細胞內的轉氨酶大量釋放出來進入血漿，血液中ALT與AST活性升高[28]。但是，在正常代謝過程中，血清中 AST 和 ALT 活性值也會維持一定水平，它們活性高低同時也反映了蛋白質合成和分解代謝的狀況[29]。本實驗中，各處理組間血清AST并無顯著差異，但是固定投喂率時發現，10%投喂率組實驗魚的血清AST活性要高于8%投喂率組的，而這兩組間在數值上僅相差11 U/L，同時，在進行切片觀察時，也未發現肝細胞有損傷或融合的現象，因此，這需要進一步研究不同投喂率下羅非魚的蛋白質代謝水平。

肝臟在糖代謝和血糖調節中發揮著重要作用。當機體能量充足時，從消化道吸收的過多血糖以糖原形式儲存于肝臟內；饑餓或禁食狀態下，肝內糖原被分解并磷酸化為6-磷酸葡萄糖，再在葡萄糖-6-磷酸酶的作用下轉化為葡萄糖釋放入血，供機體能量代謝[30]。在本實驗中，投喂率的提高使得血糖水平升高，類似的結果在對團頭魴(Megalobramaamblycephala)[5]、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[31]的研究中都有所發現，表明魚類的碳水化合物的消化或代謝增加[26]。

覃希[7]對吉富羅非魚幼魚的觀察發現，投喂率為6%的實驗魚(實驗末體質量約20 g)肝臟空泡面積小于投喂率為8%和10%的實驗室。但在本實驗中發現，投喂率8%～12%的實驗魚間未發現顯著的差異，而表觀飽食投喂組肝細胞的空泡面積比例較高。通常認為，空泡含有脂質和糖原，這與肝臟的正常代謝功能有關[32]。一些研究表明，肝臟中脂質和糖原沉積的升高是一種真正的營養病理，并可導致進行性器官病變[33]，對魚的健康造成不良影響[34]。然而，在本實驗中，有關肝臟健康狀況評價的血清指標，如TP、ALB、ALT、TCHO和TG，各組間并未顯現出明顯的差異，這似乎表明實驗結束時魚的肝臟健康狀況尚比較穩定，造成空泡面積增大的原因應該是實驗魚的生理適應[35]，但這也同時預示著長期表觀飽食投喂，可造成肝臟營養負荷過重。

綜上所述，在本實驗條件下，以生長和飼料利用為判斷指標，吉富羅非魚采用表觀飽食投喂3次/d時，可以獲得最佳的生長性能和飼料利用效率，但會產生體脂肪積累過多，肝臟細胞空泡增大等影響；若綜合考慮生長和養殖成本，以10%的投喂率，投喂2次/d為宜。