懸浮固化液相微萃取-高效液相色譜聯用測定水樣中甲硝唑和氯霉素

(1.浙江樹人大學生物與環境工程學院 杭州 310015；2.杭州師范大學錢江學院理工分院 杭州 310018)

自1959年甲硝唑(metronidazole)被合成出來后，起初是治療滴蟲病的首選藥物，其后又發現可抑制阿米巴原蟲氧化還原反應，使原蟲氮鏈發生斷裂，具有抗菌和消炎的作用[1]，現在已是臨床常用的硝基咪唑類抗微生物藥物[2]。氯霉素是一種廣譜抗生素，由于價廉及優良的抗菌性和穩定的藥效常用于動物的各種傳染病的治療中。但是，氯霉素有嚴重毒副作用，水中氯霉素殘留不僅對動物和人體有直接危害，而且還會誘發致病菌的耐藥性，易引起人體血中毒，導致不可逆的再生障礙性貧血，對人體健康構成巨大的威脅[3]。甲硝唑則存在致遺傳變異和致癌性等毒副作用[4]。

隨著水產養殖業獸藥的濫用，以及人民生活水平的提高，各種個人護理用品的廣泛使用，導致目前水中甲硝唑、氯霉素等殘留污染越來越嚴重[5]。甲硝唑和氯霉素的測定有液相色譜法、液相色譜-質譜聯用等[6，7]。在測定過程中，樣品前處理所占時間約占整個測定環節的61%。傳統的樣品前處理存在操作繁瑣，需要使用大量對人體和環境有害的有機溶劑等缺點。針對這一問題，近年來，已經發展了多種微萃取技術，如固相微萃取、液相微萃取、膜萃取等[8]。懸浮固化液相微萃取技術( solidification of floating organic drop with liquid phase microextraction, SFO-LPME)自2007年提出后[9],因其具有集樣品采集、萃取、濃縮于一體功能,而且操作簡單、成本低、富集倍率高等優點，是一種環境友好型樣品前處理新技術，可與HPLC、GC、AAS等儀器聯用，在環境污染、藥物代謝、農藥殘留、重金屬測定等痕量分析領域具有廣闊的應用前景[10]。在樣品溶液中加入幾十微升有機溶劑，分散混勻后，萃取溶劑可直接進樣分析。微萃取法集采樣、萃取和濃縮于一體，操作簡單、快速、成本低、對環境友好且富集效率高[11]。本實驗采用液相色譜法，以甲硝唑、氯霉素為研究目標，建立了以懸浮固化液相微萃取技術對水樣中甲硝唑、氯霉素含量的測定方法，該法簡便、準確、專屬性強，可用于測定水樣中甲硝唑和氯霉素。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

P230II高效液相色譜儀，包括UV230II紫外-可見檢測器、P230II高壓恒流泵、LU230II低壓梯度混合器(大連依利特分析儀器有限公司)；AB204-N電子分析天平(梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司)；07HWS-2數顯恒溫磁力攪拌器(杭州儀表電機有限公司)；KQ-300GVDV型三頻恒溫數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；GM-0.33A隔膜真空泵(天津市津騰實驗設備有限公司)；DGG-9140A型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海森信實驗儀器有限公司)；UPWS超純水器(杭州永潔達凈化科技有限公司)。

甲硝唑、氯霉素(純度≥99%，購至阿拉丁)；磷酸為分析純(國藥集團化學試劑有限公司)；甲醇為一級色譜純(天津四友)；水為超純水，正十一醇、正十二醇(上海麥克林生化科技有限公司)。

1.2 水樣懸浮固化液相微萃取方法

取20mL水樣加入100mL小燒杯中加入0.49 g十二醇，在一定溫度、pH、攪拌速度下攪拌10min，然后冰浴5min取出上浮物，融化上浮物，進行濾膜過濾，即得液相色譜進樣溶液。

2 方法

2.1 模擬水樣的制備

精確稱取甲硝唑和氯霉素適量，加水制成10μg/mL甲硝唑、20μg/mL氯霉素混合溶液，搖勻，即得。

2.2 標準貯備溶液的制備

稱取甲硝唑和氯霉素標準品用甲醇配置成1mg/mL貯備液，4℃貯存，用前逐級稀釋。

2.3 色譜條件

色譜柱：WondaCract ODS-2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，島津技邇(上海)商貿有限公司公司)；流動相：0.1%磷酸水溶液∶甲醇(80∶20)；流速：1mL/min；柱溫：45℃；波長：280nm。該色譜條件下，果糖與葡萄糖的色譜峰完全達到基線分離(R>2)。

3 結果

3.1 線性關系考察

在2.3色譜條件下，將配制好的10、20、50、80、100μg/mL的甲硝唑和50、80、100、200、400μg/mL氯霉素標準工作溶液分別用所建方法進行測定，以甲硝唑，氯霉素的色譜峰面積(Y)為縱坐標，質量濃度(X,μg/mL)為橫坐標，進行線性繪制，得到甲硝唑標準曲線回歸方程為：Y=16.83x-5.869，r=0.995；氯霉素標準曲線回歸方程為：Y=16.86x+134.7，r=0.997。并根據信噪比(S/N)=3計算出方法檢出限，結果見表1，對照品與水樣的HPLC色譜圖見圖1。

表1 甲硝唑和氯霉素的線性方程、相關系數以及檢出限

圖1 對照品與水樣的HPLC色譜圖1.甲硝唑 2.氯霉素

3.2 精密度試驗

取50μg/mL的甲硝唑、氯霉素混合標準溶液適量，按2.3項下色譜條件進行5次含量測定，記錄峰面積，計算峰面積測定結果的相對標準偏差，結果見表2、表3。結果表明，該方法具有良好的精密度和準確度。

表2 甲硝唑精密度試驗結果

表3 氯霉素精密度試驗結果

3.3 穩定性試驗

取50μg/mL、100μg/mL的甲硝唑和氯霉素混合標準溶液適量，按2.3項下色譜條件下分別在0、2、4、6、8h下進行含量測定，記錄峰面積，計算峰面積測定結果的相對標準偏差，結果見表4、表5。結果表明，該方法具有良好的穩定性。

表4 甲硝唑穩定性試驗結果

表5 氯霉素穩定性試驗結果

3.4 加樣回收率試驗

取10mL的濃度分別為5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL的甲硝唑溶液和10mL的濃度分別為10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL的氯霉素溶液按2.1項制備進樣溶液后按2.3項下色譜條件下進行含量測定，記錄峰面積，用峰面積換算十二醇中的試樣含量，計算回收率，結果見表6、表7。

表6 甲硝唑回收試驗結果

表7 氯霉素回收試驗結果

3.5 萃取條件優化

盧巧梅等人[12]在采用懸浮固化液相微萃取對食品中的兩種生長素進行方法優化時，發現萃取溫度A、十二醇用量B、鹽濃度C、pH值D、攪拌速度E等因素對體系的萃取效果都有相互影響。因此，本實驗在參考該文的萃取條件，采用5因素4平行正交試驗(表8、表9)。

表8 因素水平表

表9 正交試驗結果

表10、11的極差分析中，極差越大表明該因素對結果的影響越顯著。試驗表明pH值對水中甲硝唑的萃取效果的影響最大，然后依次是攪拌速度、NaCl濃度、提取溫度，影響最小的是十二醇的用量。攪拌速度對水中氯霉素的萃取效果的影響最大，然后依次是pH值、NaCl濃度、十二醇用量，影響最小的是溫度。甲硝唑的最佳提取條件是溫度30℃，十二醇用量為0.49g，NaCl濃度為0.1g/ml，pH為7，攪拌速度為1200r/min。氯霉素的最佳提取條件是溫度60℃，十二醇用量為0.49g，NaCl濃度為0.3g/mL，pH為5，攪拌速度為1200r/min。

表10 甲硝唑正交試驗極差分析

表11 氯霉素正交試驗極差分析

4 結論

本實驗對水樣中的甲硝唑和氯霉素建立了微萃取測定方法。得到了較佳的測定色譜條件為：WondaCract ODS-2柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，島津技邇(上海)商貿有限公司公司)；流動相：0.1%磷酸水溶液∶甲醇(80:20)；流速：1mL/min；柱溫：45℃；波長：280nm。本方法前處理較為簡便，測定準確度高、重現性好、專屬性強，可作為后續研究水中甲硝唑和氯霉素的常規測定方法。