氮素水平對寬葉雀稗生理生態的影響

王文娟，趙麗麗,2，王普昶，陳 超，余青青，張宇君

（1. 貴州大學動物科學學院草業科學系，貴州 貴陽 550025；2. 國家喀斯特石漠化防治工程技術研究中心，貴州 貴陽 550001；3. 貴州省草業研究所，貴州 貴陽 550006）

氮素是植物生長發育的必要營養元素，能促進根、莖、葉生長，提高植物光合作用和生物量積累[1-2]。在適宜范圍內，增加氮素用量可以提高植物生產性能[3]。研究發現，氮素的不足或過量會降低黑麥草(Lolium perenne)的光合作用，影響黑麥草的地上生物量積累[4]。高羊茅(Festuca arundinacea)在氮素水平較低時，其葉綠素含量下降，而過氧化物酶和超氧化物歧化酶活性增加[5]。過低或過高氮濃度會導致植株體內活性氧和丙二醛等膜脂過氧化物加速累積，進而損傷細胞膜結構，降低光合作用，影響其正常生長[6]。而增加施氮量能夠提高植物中葉綠素含量，促進植物的光合作用[7]。

寬葉雀稗(Paspalum wettsteinii)是一年生或多年生的禾本科牧草，在我國西南山區以適應性強、耐土壤瘠薄等特性成為栽培草地建植、水土保持和綠化的常用植物，顯示出較好的生態、經濟效益[8-9]。氮素水平對寬葉雀稗生物量的積累影響極大。目前，關于寬葉雀稗的研究主要集中在種子休眠特性、抗旱性、播種方法等方面[10-12]，而氮素對寬葉雀稗生理及光合特性的影響尚未見報道。為初步揭示寬葉雀稗對氮素的適應機制，探究適合寬葉雀稗生長的氮素水平，本研究對不同氮素水平下寬葉雀稗生長的生理指標及光合特性進行動態分析，以期通過生長、生理、光合的變化，為寬葉雀稗的高效栽培提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料與試驗設計

寬葉雀稗種子由貴州省草業研究所提供。

選擇顆粒飽滿、大小均勻的寬葉雀稗種子，采用紙上發芽法，于25 ℃的恒溫培養箱中進行萌發和幼苗培養。培養5周后，選擇三葉一心的幼苗進行砂培。砂培基質是1～2 mm石英砂，提前用稀鹽酸浸泡48 h去除雜質，洗凈、曬干后裝入塑料桶 (直徑 20.5 cm、高 20.3 cm)，每桶裝石英砂 10 kg，并種植3株寬葉雀稗。

以改良霍格蘭營養液為基礎，設置5個供氮水平，濃度梯度分別為 N1(1 mmol·L-1)、N2(3 mmol·L-1)、N3(5 mmol·L-1)、 N4(7 mmol·L-1)、 N5(9 mmol·L-1)。其中N3是改良霍格蘭營養液標準配方中的氮素水平，設為對照組。改良霍格蘭營養液中，大量元素配方如表1所列；鐵鹽溶液配方為FeSO4·7H2O 13.90 mg·L-1，EDTA 18.61 mg·L-1，pH 5.5～6.5。

表 1 不同氮素水平營養液大量元素的配方Table 1 A large number of elements in nutrient fluids at different nitrogen levels

微 量 元 素 配 方 為 KI 0.83 mg·L-1， H3BO36.20 mg·L-1， MnSO4·4H2O 22.30 mg·L-1， ZnSO4·7H2O 8.61 mg·L-1， Na2MoO40.25 mg·L-1， CuSO4·5H2O 0.03 mg·L-1，CoCl20.03 mg·L-1。每個水平設置 3 次重復，每隔5 d更換一次營養液。分別在7、14、21和28 d進行生理和光合指標的測定。各處理取植株第2片完全展開的葉片，于天氣晴朗的上午09：00-11：00進行光合特性的測定，隨后將所測葉片剪碎混勻進行生理指標的測定，每次測定重復3次。28 d后測定株高、葉長、葉寬等形態指標，并刈割測定生物量和含氮量，重復3次。

1.2 測定指標及方法

株高、葉長、葉寬、根長用直尺和游標卡測量，鮮重和干重采用稱重法。植株含氮量采用凱氏定氮法[13]測定。過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚法[14]測定；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度計法[14]測定；超氧化物歧化酶(SOD)采用氮藍四唑光還原法[14]測定；丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法[15]測定；可溶性蛋白(SP)含量采用考馬斯亮藍法[14]測定；脯氨酸(Pro)含量采用酸性茚三酮比色法[14]測定。葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)及總葉綠素(Chlt)含量采用

紫外分光光度計測定。葉片的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2濃度(Ci)和氣孔導度(Gs)等光合指標采用多葉室動態光合儀測定。

1.3 數據處理

采用SPSS 17.0統計軟件對不同氮素水平下寬葉雀稗各時間段的形態、生理及光合指標進行Duncan方法的顯著性分析。采用Excel 2003進行圖表的繪制。參照鄭清嶺等[16]的研究，以處理時間最長(28 d)的各指標作為基礎數據，采用主成分分析結合模糊隸屬函數公式對氮素處理效果進行綜合分析。計算公式如下：

式中：μ(Xi)為各氮素水平Xi的隸屬函數值，Xi為各氮素水平綜合指標i的值，Ximax和Ximin分別為各氮素水平Xi的最大值和最小值，Pi為綜合指標i的貢獻率，Wi為綜合指標i的權重，D為各氮素水平的綜合評價值[17-19]。

2 結果

2.1 氮素水平對寬葉雀稗生長的影響

不同氮素水平下，寬葉雀稗的各項指標變化趨勢基本一致(表2)。隨著氮素水平增加，株高、葉長、葉寬和根長均出現先升高后降低的趨勢。其中，N2處理下各指標達到最大，分別為39.77、31.07、2.03和27.57 cm。N5處理下寬葉雀稗長勢最差，與對照組(N3)相比各指標均顯著降低(P＜0.05)，分別下降了 16.23%、16.00%、13.71%和17.74%。說明過高的氮素水平不利于寬葉雀稗生長。

表 2 不同氮素水平對寬葉雀稗生長的影響Table 2 Effect of different nitrogen levels on the growth of P. wettsteinii

2.2 氮素水平對寬葉雀稗生物量及含氮量的影響

隨著氮素水平逐漸增加，寬葉雀稗的地上和地下部分生物量及含氮量均呈現先上升后下降的趨勢，在N2處理下達到最大。除地下部分含氮量外，N2與N3處理下各項指標均無顯著差異(P＞0.05)。與N3處理相比，N5處理下降幅度最大，地上和地下部分鮮重、干重及含氮量分別減少了42.43%、56.99%、19.13%和45.19%、71.43%、16.13%。進一步說明，高氮素水平對寬葉雀稗生長有明顯的抑制作用(表3)。

2.3 氮素水平對寬葉雀稗生理指標的影響

各處理時間梯度下，寬葉雀稗的SP含量均隨著氮素水平增加先升高后下降。不同氮素水平下，寬葉雀稗的SP含量均在28 d達到峰值，分別較處理7 d時的SP含量顯著增加309.12%、364.86%、320.63%、325.80%和277.50%。SP是植物體內能緩解環境脅迫對其損傷的一種保護物質。N2處理下SP含量增幅最大，說明N2處理對于寬葉雀稗SP含量積累最有利(圖1)。

Pro含量隨寬葉雀稗生長時間延長而上升，且各時間段內(除生長7 d外)均表現為隨氮素水平的增加先升高后下降。除生長7 d外，其他時間寬葉雀稗中Pro含量均以N2和N3處理較高，尤以N2處理最高。在28 d時，N2處理下的Pro含量達到了 37.35 μg·g-1，顯著 (P＜0.05)高于其他處理 (圖 1)。

表 3 不同氮素水平對寬葉雀稗生物量分配及含氮量的影響Table 3 Effect of different nitrogen levels on biomass allocation and nitrogen content of P. wettsteinii

圖 1 不同氮素水平對寬葉雀稗可溶性糖(SP)和脯氨酸(Pro)含量的影響Figure 1 Effect of different nitrogen levels on soluble protein and proline content of P. wettsteinii

不同氮素水平處理下，寬葉雀稗的MDA含量隨著時間增加而增加，總體表現為 N5＞N4＞N1＞N3＞N2。與處理7d相比，N1-N5處理28d 的MDA含量均顯著增 加 (P＜0.05)，增幅依次為68.13%、52.19%、56.82%、73.95%和95.93%。N5處理下MDA含量增幅最大，脂膜穩定性最差(圖 2)。

隨處理時間的延長，各氮素水平下(除N1處理)寬葉雀稗的POD活性均逐步增加，在28 d達到峰值。與處理7 d相比，處理28 d的POD活性均有顯著(P＜0.05)增加，以N2處理下POD活性最高，為 1 373.77 U·g-1，N5處理下 POD 活性最低，為 733.01 U·g-1(圖 2)。

隨處理時間的增加，CAT和SOD活性均不斷增加。各氮素水平下CAT活性均在28 d達到峰值，且各處理間存在顯著(P＜0.05)差異。與處理7 d相比，N1-N5在處理28 d時的CAT活性增幅分別為565.41%、206.58%、237.25%、260.14%和174.69%。28 d時，N2處理的SOD活性達到最大，為869.29 U·g-1。與 N2相比，N1、N3、N4、N5氮素水平的SOD活性分別下降了27.13%、2.44%、36.69%和49.97%(圖 2)。

2.4 氮素水平對寬葉雀稗葉綠素含量的影響

隨生長時間的延長，寬葉雀稗葉片中Chl a、Chl b和Chl t的含量基本趨于一致，均先上升后下降。其中，N2、N3和N4處理下寬葉雀稗葉片中葉綠素含量顯著高于 N1和 N5(P＜0.05)。與處理 7 d相比 N1-N5在處理 28 d 時的 Chl a 含量分別增加76.91%、39.10%、25.53%、55.54%和92.24%；Chl b含量分別增加 40.52%、61.34%、60.48%、63.93%和 81.63%；Chl t含量分別增加 158.03%、36.07%、32.62%、45.01%和129.16%(圖3)。

2.5 氮素水平對寬葉雀稗光合作用的影響

圖 2 不同氮素水平對寬葉雀稗MDA、POD、CAT和SOD活性的影響Figure 2 Effect of different nitrogen levels on malondial-dehyde content (MDA), peroxidase (POD),catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activity of P. wettsteinii

隨氮素水平的增加，各處理時間段內葉片Pn、Tr和Gs均表現為先上升后下降。隨處理時間的推移，Pn、Tr和Gs總體呈現增加趨勢。與處理7 d相比，處理28 d時的Pn增幅依次為48.25%、44.09%、25.12%、49.91%和70.84%。28 d時，N2處理下葉 片中Tr較高，尤以N2處理最高，為2.30 mmol·(m2·s)-1。與N2處理相比，N5處理下Tr顯著下降了29.13%。與處理 7 d相比，處理 28 d時 Gs明顯增長，N2處理下Gs上升幅度最大, 增加了122.31%；N1處理下Gs上升幅度最小，增加了77.65%。Ci處理期間持續減少，N4和N5處理Ci始終高于其他處 理組，兩組間無顯著差異。28 d時，N4和N5處理下 Ci分別為 372.13 和 378.87 μmol·mol-1(表 4)。

圖 3 不同氮素水平對寬葉雀稗葉綠素含量的影響Figure 3 Effect of different nitrogen levels on Chlorophyll content of P. wettsteinii

2.6 氮素處理對寬葉雀稗影響的綜合評價

相關性分析發現，各指標間存在極顯著(P＜0.01)或顯著(P＜0.05)相關關系，因此有必要利用主成分分析將其轉變為相互獨立的綜合指標。

對23個指標進行主成分分析，按照特征值大于1及提取的主成分累積貢獻率超過85%，確定前3個主成分為綜合指標。前3個主成分的特征根分別為16.56、2.00和1.55，累積貢獻率為87.42%。在第1主成分中，POD、CAT和SOD的載荷量較大；在第2主成分中，Chl a、葉寬和葉長的載荷量較大；在第3主成分中，Chl a、Tr和Ci的載荷量較大。

由主成分分析結果可得3個綜合指標的線性方程組。其中，X1、X2和X3分別代表了3個主成分，以各指標的載荷量為系數，x1～x23分別代表23個指標。

通過主成分表達式及隸屬函數公式分別求出不同氮素水平對寬葉雀稗的綜合指標值、隸屬函數值、各綜合指標權重以及綜合評價值(D值)。綜合評價值越大，表明氮素水平對寬葉雀稗生長的促進作用越強，反之則弱。結果得出，N2處理的綜合評價值最大(0.88)，綜合排序第1，表明該氮素處理水平對寬葉雀稗生長最有利(表5)。

表 5 不同氮素水平下寬葉雀稗的綜合指標評價及排序Table 5 Comprehensive index and sort of P. wettsteinii in different nitrogen levels

3 討論

3.1 寬葉雀稗對不同氮素水平的生長、生理及光合適應

在一定范圍內添加氮素對植物株高、根長、生物量等表征生長發育的各項指標具有正向調控作用[20]。本研究表明，隨著氮素水平的增加，寬葉雀稗的株高、葉長、葉寬、根長、生物量及含氮量均呈先上升后下降的趨勢。有研究發現，在氮素供應不足的范圍內，氮素含量增加會顯著提高株高、生物量及氮含量，一旦超過植物最適氮素的含量，株高、生物量及氮含量等指標將不再增加，甚至會呈現出下降的趨勢[21-22]。本研究中，在氮素水平為3 mmol·L-1時，寬葉雀稗的株高、葉長、根長等指標均達到了峰值；之后隨著氮素水平的增加，株高、葉長、葉寬等指標開始降低，表明過量的氮素會抑制寬葉雀稗生長。

為了抵御逆境中植物體內積累的大量活性氧，滲透調節物質和保護酶活性均會發生變化，從而減少植物細胞質膜系統的損傷[23]。作為植物的滲透調節物質，SP和Pro含量的高低能反映植物的耐受性。王賀正等[24]研究發現，合理施氮能夠提高小麥(Triticum aestivum)葉片的滲透調節能力，降低膜脂過氧化程度。但過高的施氮量會抑制保護酶的活性。本研究中，隨著氮素水平的增加，各處理時間梯度下寬葉雀稗的SP和Pro含量、POD、CAT、SOD保護酶活性均呈現先上升后下降的趨勢。與對照組相比，氮素水平較低(3 mmol·L-1)處理的寬葉雀稗體內SP和Pro含量、POD、CAT、SOD保護酶活性均保持在較高的水平，這可能是植物對于逆境的一種補償機制。MDA含量與植物受到的傷害程度呈正比，高氮素水平(7～9 mmol·L-1)下MDA含量顯著增加，說明氮素水平過高導致植物細胞內活性氧的大量積累，加速細胞膜脂過氧化作用，更大程度地損傷了植物的質膜系統，影響植物生長。陳繼康等[25]研究不同氮素水平對苧麻(Boehmeria nivea)氮代謝關鍵酶的影響，其趨勢變化與本研究結果相似。

光合作用是植物將光能轉換為自身生長所需化學能的過程。在這個過程中，葉綠素發揮著光能吸收和轉化的重要作用。植物葉片中葉綠素含量是衡量植物光合作用和營養脅迫的重要指標之一[26-27]。有研究表明，增加施氮量可提高植物葉片中葉綠素的含量，從而增強植物自身的光合作用，但濃度過高的氮素卻不利于葉綠素含量的積累[28-29]。一般認為氣孔限制和非氣孔限制是影響植物光合作用的主要因素。Farquhar和Sharkey[30]認為，植物葉片中Pn、Gs與Ci變化趨勢一致，說明Pn的降低主要是由氣孔因素所致；反之，則表明非氣孔限制是Pn降低的主要限制因素。本研究表明，隨著氮素水平的增加，Chl a、Chl b 和 Chl t葉綠素含量及Pn、Tr和Gs光合指標均呈現先上升后下降的趨勢。而Ci的變化趨勢與之相反，表明寬葉雀稗的光合作用是非氣孔限制。在氮素水平為1 mmol·L-1時，葉綠素含量均很低，說明此時的寬葉雀稗處于氮饑餓狀態，氮素不足阻礙葉綠素合成，影響植株的光合作用，進而影響生長發育。在氮素水平為 3 mmol·L-1時，Chl a、Chl b 和Chl t的含量有所增加，Pn、Tr和Gs顯著增加。葉綠素含量在輕微脅迫下增加，這可能是植物對于逆境的一種補償機制，而葉綠素含量增加有利于增強光合作用，使植物適應在逆境中生長。張緒成和上官周平[31]、陸艷婷等[32]的研究結果也表明，適量的增加氮素會使植物葉片中的葉綠素含量升高，Pn、Tr和Gs也相應增加，而Ci有下降趨勢。

3.2 不同氮素水平對寬葉雀稗各指標的綜合評價

氮素對植物生長發育有很大的影響，不同的氮素水平下植物各指標的變化也不盡相同。寬葉雀稗對氮素適應是一個復雜過程，單一或是幾個指標不能準確表達氮素水平對于寬葉雀稗生長的影響，以上所測各指標間有較強的相關性，用單一或是幾個指標評價會出現信息重疊或遺漏的問題，故需要對各指標進行綜合分析。孫建等[33]利用主成分分析和隸屬函數相結合的方法科學評價了43個單項指標抗旱系數，為芝麻(Sesamum indicum)抗旱性鑒定提供了參考方法。本研究利用模糊隸屬函數和主成分分析，對不同氮素水平寬葉雀稗幼苗各指標進行綜合分析。寬葉雀稗在不同氮素水平下的綜合評價值排序為 N2＞N3＞N1＞N4＞N5。

4 結論

適量的氮素水平可以增加寬葉雀稗的株高、根長、生物量和含氮量，增強酶活性，降低膜脂過氧化程度，增加葉綠素及光合作用。隨著氮素水平的增加，對寬葉雀稗生長的抑制明顯增強。23個指標經過隸屬函數和主成分分析綜合評價得出，3 mmol·L-1是最適宜寬葉雀稗生長的氮素水平。該結論為寬葉雀稗推廣種植提供了理論基礎。