外源6-BA對紫花苜蓿盛花期葉片光合、生理特性及結莢率的影響

宋佳琦，王玉祥，張 博

（新疆農業大學草業與環境科學學院 / 新疆西部干旱荒漠區草地資源與生態省部共建教育部重點實驗室，新疆 烏魯木齊 830052）

光合作用是植物生命活動的核心反應，是光化學同化物積累、轉運的前提，是植物形成有效產量的保障。在經濟作物的生產中發現，外源激素對植物光合作用有重要調控作用，其中細胞分裂素促進光合作用的進行，增加葉片內葉綠素蛋白的合成，減少葉綠素的降解，促進葉綠體中基粒的形成，影響葉綠體基因的表達和葉綠體DNA的合成[1-2]。外源細胞分裂素可以減輕植物葉片衰老，促進抗衰基因的表達，使植物組織中信使RNA含量升高，保護RuBp羧化酶的結構，使植物的光合作用可以順利進行[3-4]。6-芐氨基嘌呤(6-Benzylaminopurine, 6-BA)是細胞分裂素的一種，其生物活性強，可有效延緩植物葉片衰老，提高葉片中抗氧化酶活性，及時清除葉片內過多的自由基[5-6]，提高葉片的凈光合速率、葉綠素含量，并減小葉片氣孔阻力[7]。外源6-BA提高葉片光合能力不僅與氣體交換參數相關，與光合機構中光合電子傳遞鏈也相關，幫助光合電子順利傳遞，減輕光合機構的損傷程度[8-10]。外施6-BA還可提升大豆(Glycine max)[11]、羽扇豆(Lupinus micranthus)[12]、水稻(Oryza sativa)[13]等經濟作物的結實率及種子產量，對植物的開花結實有重要影響。

紫花苜蓿(Medicago sativa)為簇生總狀的無限花序，小花數量龐大，但種子產量低。目前有關紫花苜蓿種子生產的研究，多數集中于栽培措施方面，但紫花苜蓿種子產量依然較低。紫花苜蓿生殖生長過程中，光合作用的順利進行有利于光化學同化物的產生和積累，為生殖器官的生長發育提供充足的營養物質，防止因營養物質的缺失導致小花敗育及花莢的脫落，從而影響種子產量。通過葉面噴施乙烯利、多效唑增加了紫花苜蓿單位面積花序數、單位面積結莢花序數和每花序莢果數，提升了潛在種子產量[14-15]，表明施用植物生長調節劑可影響苜蓿的種子產量。王玉祥[16]研究激素與水肥對苜蓿生殖生長和種子產量的影響，結果表明，在苜蓿盛花期噴施不同濃度的6-BA、 赤 霉 素 (Gibberellin, GA)和 生 長 素 (Auxin,IAA)，對苜蓿的結莢率和種子產量有不同程度的影響，適宜濃度的6-BA可提高種子產量，但未從植物生理層面探討影響苜蓿種子產量的原因?；诖耍狙芯恳孕履?號紫花苜蓿為試驗材料，現蕾期噴施不同濃度6-BA，探討外源6-BA對苜蓿盛花期葉片光合作用、抗氧化系統及結實性的影響，以期為細胞分裂素在苜蓿生產中的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為新牧4號紫花苜蓿(Medicago sativa‘Xinmu No.4')，由新疆農業大學“西部干旱荒漠區草地資源與生態”省部共建教育部重點實驗室提供。

1.2 試驗處理

于2017年5至7月在新疆農業大學三坪農場試驗站進行田間試驗，2016年秋季播種，行距60 cm，播量 30 kg·hm-2，播深 1～2 cm，采用地下滴灌的方式進行灌溉，試驗期間進行正常的田間管理。試驗采用隨機區組設計，在苜蓿返青期選取生長狀況一致的地塊劃分小區，小區面積 15 m2(3 m × 5 m)，試驗設置4個處理，每個處理3次重復。苜?，F蕾期用手持噴霧器噴施人工合成細胞分裂素(6-BA)，6-BA 濃度設置為 10、20 和 30 mg·L-1，清水為對照。為了使6-BA能更好地附著在葉片，6-BA溶液及清水均含0.5%的吐溫-20，噴灑量為每個小區2 L溶液，噴施時間為08:00和20:00，每天噴施2次，連續噴施 3 d。

1.3 測定內容與方法

在苜蓿盛花期隨機選取功能葉測定光合參數和熒光參數，每個參數測定10次重復。同一時間隨機選取相同葉位的苜蓿葉片，放在錫箔紙內包裹好，迅速放入液氮中，速凍24 h，然后將樣品轉入-40 ℃的冰箱內，用于測定生理指標。

1.3.1 光合參數的測定

天氣晴朗時用光合儀(型號：PP-SystemCRIAS-2)進行測定，葉室溫度約為30 ℃，光照強度約為2 000 μmol·(m2·s)-1，CO2濃度 (Ca)約為 420 μmol·L-1，測定最大凈光合速率 [Pn，μmol·(m2·s)-1]、胞間 CO2濃度 (Ci， μmol·mol-1)、蒸騰速率 [Tr，μmol·(m2·s)-1]和葉片水分利用效率 (WUE，μmol·μmol-1)。

1.3.2 熒光參數的測定

天氣晴朗時用植物效率分析儀(型號：Handy-PEA)測定葉片快速葉綠素熒光動力學曲線(O-J-I-P曲線)，測定時間為16:00(光照最強)，測定前在葉片上夾上葉夾，在黑暗條件下適應30 min后進行測定。試驗用到熒光參數為：初始熒光(Fo)，以吸收光能為基礎的光化學性能指數(PIABS)，最大光化學效率(Fv/Fm)，光系統Ⅱ(PSⅡ)潛在光化學效率(Fv/Fo)。

1.3.3 生理指標的測定

可溶性糖含量采用蒽酮比色法測定，游離脯氨酸采用酸性茚三酮法測定，過氧化氫含量采用分光光度法測定，超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)光下還原法測定，過氧化物酶(POD)活性采用愈創木酚比色法測定，過氧化氫酶(CAT)活性采用高錳酸鉀滴定法測定[17]。

1.3.4 結實性觀測

單序小花數：在盛花期，各小區隨機選取30個花序，統計小花數量；單序莢果數：在完熟期，各小區隨機選取30個花序，統計莢果數量；千粒重：在收獲的種子中隨機數出1 000粒種子稱重，重復10次；單株種子產量：種子成熟后在各個小區中隨機選取10株苜蓿，每株單獨收獲拷種。

結莢率 = (單序莢果數/單序小花數) × 100%。

1.4 數據處理

數據使用Excel 2010錄入，Origin8.0作圖。采用SPSS 20.0軟件對種子產量、光合參數、熒光參數、抗氧化酶活性進行單因素方差分析及Duncan多重比較。

2 結果與分析

2.1 外源6-BA對苜蓿盛花期葉片光合參數的影響

10和 20 mg·L-16-BA處理后，苜蓿葉片 Pn、Tr、WUE 均顯著高于對照，Ci顯著 (P＜0.05)低于對 照 (圖 1)，20 mg·L-16-BA 處 理 后 Pn、Tr、WUE值最大，分別高于對照39.34%、17.99%和18.06%，Ci低于對照 7.11%。在 30 mg·L-16-BA 處理下，苜蓿葉片 Pn和 WUE分別顯著 (P＜0.05)低于對照2.94%和14.05%，Ci顯著高于對照6.33%。以上結果表明，10和20 mg·L-16-BA可提高苜蓿葉片的光合能力，提高葉片對CO2的利用率，減少細胞間隙CO2的積累。

2.2 外源6-BA對苜蓿盛花期葉片熒光參數的影響

初始熒光(Fo)是葉片在黑暗適應下PSⅡ反應中心完全開放時的熒光產量，如圖2所示，隨著6-BA處理濃度遞增，Fo逐漸減少，表明6-BA可降低葉綠體類囊體膜結構的損傷。最大光化學效率(Fv/Fm)、PSⅡ潛在光化學效率(Fv/Fo)和光合性能指數(PIABS)可反映葉片光合機構的損傷程度及光抑制程度，20 和 30 mg·L-16-BA 處理后，Fv/Fm、PIABS和Fv/Fo均高于對照，表明外源6-BA可降低強光照射下葉片的光抑制程度，減小光合機構的損傷程度。

2.3 外源6-BA對苜蓿盛花期葉片抗氧化酶活性的影響

30 mg·L-16-BA處理，葉片中SOD活性顯著高于 其 他 處 理 (P＜ 0.05)(圖 3)， 較 對 照 高 4.05%。10和20 mg·L-16-BA處理，顯著提高POD和 CAT活性。6-BA 濃度為 20 mg·L-1時 POD 和 CAT 活性最強，分別高于對照5.62%和11.49%。說明外源6-BA可增強苜蓿盛花期葉片抗氧化酶活性，減緩活性氧對光合器官的破壞。

2.4 外源6-BA對苜蓿盛花期葉片滲透調節物質和過氧化氫含量的影響

10 mg·L-1處理下，苜蓿盛花期葉片中可溶性

圖 1 不同濃度6-BA對苜蓿盛花期葉片光合參數的影響Figure 1 Changes of photosynthetic parameters of alfalfa at flowering stage under different concentrations of 6-BA

糖含量顯著高于其他處理 (P＜0.05)(圖4)，其次為20 mg·L-1和 30 mg·L-1處理。不同濃度 6-BA 均使葉片內脯氨酸含量較對照顯著增多(P＜0.05)，20 mg·L-1處理下，脯氨酸含量最高，是對照的1.36倍。10和20 mg·L-1處理下葉片中過氧化氫含量顯著低于對照 (P＜0.05)，6-BA 濃度為 30 mg·L-1處理下，苜蓿葉片內過氧化氫含量較對照高0.51 nmol·g-1。

2.5 外源6-BA對苜蓿結實性的影響

隨著6-BA濃度遞增，苜蓿的單序小花數逐漸增多，30 mg·L-1處理單序小花數最多，顯著高于對照(P＜0.05)(表1)；6-BA處理后苜蓿單序莢果數均顯著高于對照；20 mg·L-1處理最高；同樣在20 mg·L-1處理苜蓿結莢率最高 (57.06%)，顯著高于對照和 30 mg·L-1處理的。20 mg·L-1處理苜蓿種子千粒重顯著高于對照和 30 mg·L-1處理的，10 mg·L-1處理種子千粒重是對照的1.31倍，說明10 mg·L-16-BA處理苜蓿種子較飽滿。不同濃度6-BA對苜蓿單株種子產量影響較大， 20 mg·L-16-BA，苜蓿單株種子產量最高，為5.73 g，是對照種子產量的1.11倍，比10 mg·L-1處理單株種子產量提高了 3.43%(P＞0.05)。以上分析表明，外源 6-BA 可提高苜蓿種子產量，20 mg·L-1處理最好，其次為10 mg·L-1。

3 討論

外源6-BA可提高植物光合速率在多種經濟作物中已有研究報道，張海娜等[18]研究發現，經10 mg·L-1的6-BA處理后，棉花(Gossypiumspp.)葉片Pn增加。經6-BA處理后葡萄(Vitis vinifera)葉片的Pn及葉綠素含量升高，并且延長葡萄葉片光合作用功能期[19]。在水分脅迫下，外施6-BA可以增強小麥(Triticum aestivum)的光合特性[20]。吳雪霞等[21]也發現在低溫脅迫下，外源6-BA可以增強茄子

圖 2 不同濃度6-BA對苜蓿盛花期葉片熒光參數的影響Figure 2 Changes of chlorophyll fluorescence parameters of alfalfa at flowering stage under different concentrations of 6-BA

圖 3 不同濃度6-BA對苜蓿盛花期葉片抗氧化酶活性的影響Figure 3 Changes of antioxidant enzyme activities in leaves of alfalfa at flowering stage under different concentrations of 6-BA

(Solanum melongena)幼苗光合能力，使茄子幼苗的Pn、Ci、Tr、Gs均有所提高。相關研究也表明，6-BA可影響植物葉片氣孔運動，增加葉片氣孔開度，減小氣孔對CO2擴散的阻力，同時提高RuBP羧化酶等光合作用相關酶的活性，促進光合磷酸化反應的進行[22-23]。在本研究也發現，10和20 mg·L-16-BA 處理后，苜蓿葉片的 Pn、Tr、WUE 均高于對照，提高了苜蓿葉片的光合能力，并且促進光合作用中CO2的吸收和利用。而30 mg·L-16-BA處理后，苜蓿葉片的Pn低于對照。植物葉片Pn下降的原因分為兩種情況，一是非氣孔限制因素，表現為Pn下降的同時伴隨Ci的升高；二是氣孔限制因素，表現為Pn下降的同時，Ci也隨之下降[24-25]。本研究中發現，6-BA 濃度為 30 mg·L-1的 處理下，苜蓿葉片Pn低于對照，Ci高于對照，表明葉片光合速率下降的原因主要為非氣孔限制因素，這可能與光化學活性限制、1,5-二磷酸核酮糖羧化限制和無機磷限制等因素，阻礙了CO2的利用，從而造成細胞間隙CO2積累，降低了該處理下苜蓿的光合速率。

圖 4 不同濃度6-BA對苜蓿盛花期葉片脯氨酸、可溶性糖及過氧化氫含量的影響Figure 4 Changes of proline, soluble sugar and hydrogen peroxide content in alfalfa during flowering stage under different concentrations of 6-BA

表 1 不同濃度6-BA對苜蓿結莢率的影響Table 1 Effect of different concentrations of 6-BA on alfalfa pod rate

葉綠素熒光動力學參數可以分析高等植物光系統Ⅱ(PSⅡ)內部不同光電子傳遞過程中的變化和調控作用。在外源6-BA處理后可以顯著提高小麥旗葉的Fv/Fm、實際光化學效率(ΦPSⅡ)、光合電子傳遞速率(ETR)[26]。羅黃穎等[27]研究發現外施吡效隆(CPPU)和6-BA對鹽脅迫下番茄(Lycopersicon esculentum)葉片的葉綠素熒光有影響，使番茄葉片主要熒光參數升高。張國斌等[28]也發現，在低溫弱光脅迫下辣椒(Capsicum annuum)幼苗經6-BA處理后Fv/Fm、Fv/Fo等熒光參數有所提高。本研究中，噴施不同濃度6-BA使苜蓿葉片的Fo下降，Fv/Fm、Fv/Fo及PIABS升高；隨6-BA濃度上升，苜蓿葉片的Fo逐漸降低，表明6-BA可保護葉片類囊體膜結構，減緩PSⅡ的反應中心失去活性。不同濃度6-BA均使苜蓿葉片Fv/Fm有不同程度的提升，說明6-BA可減輕苜蓿葉片在光合作用時的光抑制程度，減緩因光能過剩而使光合電子不能繼續傳遞，對光合機構有保護作用。

外源6-BA可提高油茶(Camellia oleifera)葉片SOD酶活性，減少葉片內丙二醛(MDA)的積累，減輕油茶葉片膜脂過氧化作用[29]。經外源6-BA處理后，能延緩離體雜交水稻葉片的衰老，促進葉片內抗氧化酶中的SOD、POD、CAT的活性增強，減少活性氧的積累[30]。獼猴桃(Actinidia chinensis)經不同濃度6-BA處理后，葉片內葉綠素降解變慢，SOD酶活性下降緩慢，膜透性減小，延緩葉片衰老[31]。植物組織中抗氧化酶活性較高，可及時清除自由基，減緩活性氧等物質對光合機構的破壞，促進光合磷酸化反應，提高光和電子傳遞效率，有利于光合作用的進行。在本研究中，不同濃度6-BA均使苜蓿葉片內SOD、POD、CAT酶活性增強，脯氨酸及可溶性糖含量高于對照，減少了葉片內過氧化氫的積累，效果最佳的處理為20 mg·L-1的6-BA。

外源6-BA可提高植物的坐果率，增加產量，減少果實的脫落，張文學等[32]在齊穗期通過葉面噴施30 mg·kg-1的6-BA，發現6-BA可提高水稻的結實率，與對照相比提高3.85%，并且提高了種子的千粒重。在豇豆(Vigna unguiculata)、羽扇豆(Lupinus micranthus)、草地早熟禾(Poa pratensis)的研究中也發現，葉面噴施細胞分裂素可提高其結莢率和種子產量[33-35]。本研究中，10 和 20 mg·L-1的6-BA處理后，苜蓿的結莢率、千粒重及種子產量均高于對照，表明6-BA可提高紫花苜蓿結莢率和種子產量。但 30 mg·L-16-BA 處理下，雖然單序小花數最多，但單序莢果數較少，所以結莢率及種子產量僅略高于對照，這可能是由于噴施的6-BA溶液濃度較高，影響了苜蓿的內源激素調控網絡，導致了苜蓿花和莢的脫落。

4 結論

20 mg·L-16-BA處理后，提高了苜蓿葉片的光合能力和葉片的抗氧化酶(POD、SOD、CAT)活性，減輕了葉片的膜脂過氧化程度，并提高了苜蓿的結莢率及單株種子產量，與對照相比，結莢率提高了14.08%，單株種子產量提高了11.48%。