柱花草SgSTOP1和SgSTOP2基因的克隆與表達分析

羅佳佳，向晨瑩，劉攀道，胡 璇，唐 軍，王文強，劉國道，陳志堅

（1. 海南大學熱帶農林學院，海南 海口 570228；2. 中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所 /農業部華南作物基因資源與種質創制重點實驗室，海南 儋州 571737）

世界范圍內，超過50%的可耕作土壤為pH低于5.0的酸性土壤，并主要分布于熱帶和亞熱帶地區[1]。在我國，有超過2 000萬hm2土壤為酸性土壤，占全國耕地面積的21%[2]。酸性土壤存在著多種限制作物生長的不利因素，主要包括金屬離子毒害 (如 Al3+、Fe3+、Mn2+等)和養分缺乏 (如 P、Ca、Mg等)[3]。在酸性土壤中，Al3+能通過阻礙細胞分裂和伸長而抑制根系生長，阻礙根系對礦質營養和水分的吸收[4]。在長期進化過程中，植物形成了一系列適應鋁毒脅迫的機制。例如，植物受到鋁毒脅迫時，可以促進根分泌有機酸，螯合根際鋁離子，阻止鋁進入細胞。進入細胞的Al3+可被固定在細胞壁內，或被有機酸螯合并隔離在液泡中，從而緩解鋁毒害[5]。

鋅指轉錄因子 STOP(sensitive to proton rhizotoxi city)是Cys-2-His-2(C2H2)型轉錄因子家族成員[6]。C2H2鋅指蛋白(ZF)是核酸綁定蛋白，定位于細胞核中，起轉錄調控作用[7]。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，AtSTOP1含有4個高度保守的C2H2鋅指結構域(ZF domain)，能調控下游耐鋁關鍵基因表達，如鋁激活表達蘋果酸轉運子AtALMT1(Aluminum acti vated malate transporter 1)、鋁敏感因子AtALS3(Aluminum sensitive 3)和檸檬酸轉運蛋白AtMATE1(Multidrug and toxic compound extrusion 1)[8-9]。 擬 南 芥stop1突變體對鋁極為敏感，根系生長嚴重受阻，這可能是由于耐鋁相關基因表達受阻所致[8]。近年來，在其他植物中，相繼克隆了與AtSTOP1同源的基因，如水稻(Oryza sativa)[10-12]和煙草(Nicotiana tabacum)[13]。因此，STOPs在植物抵御鋁毒脅迫中起重要的調控作用。

柱花草(Stylosanthes guianensis)起源于熱帶和亞熱帶地區，是重要的豆科牧草，可作為飼草喂養牲畜、作為綠肥覆蓋果園和改良土壤等[14-16]。柱花草具有較強的耐鋁毒能力，是研究植物適應酸性土壤鋁毒脅迫機制的優良材料[17-18]。研究發現，柱花草蘋果酸酶基因SgME1(malic enzyme)具有調控根系蘋果酸合成螯合鋁離子的功能，是柱花草耐酸鋁脅迫的重要基因[19]。目前，對柱花草耐鋁毒能力評價的研究較多，但其耐鋁毒的分子調控機制尚不清楚。因此，本研究以柱花草為材料，克隆獲得了柱花草兩個鋅指轉錄因子SgSTOP1和SgSTOP2，并對其進行生物信息學和表達模式分析，以期為進一步探索柱花草適應鋁毒脅迫的分子調控機制提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的8份圭亞那柱花草(Stylosanthes gui anensis)基因型分別為TPRC2001-1、TF268、TF305、TF387、TF238、TF278、TF207、TF323。柱花草種子由中國熱帶農業科學院熱帶作物品種資源研究所熱帶牧草研究室提供。

1.2 方法

1.2.1 鋁處理和相對根長測定

參照Sun等[19]方法，挑選飽滿的柱花草種子剝去種殼，80 ℃水浴3 min，冷卻后播種于浸潤500 μmol·L-1CaSO4溶液的濾紙上。柱花草幼苗根長至2 cm時，進行2個鋁濃度處理，分別為0 μmol·L-1AlCl3(對照，CK)和 60 μmol·L-1AlCl3(鋁處理，Al)，每個處理設置4個生物學重復。分別在處理 0和 24 h后，用根系掃描儀 (EPSON，日本)掃描根長圖像，并用根系分析軟件Image J(National Institutes of Health， 美 國 )統 計 根 長 (root

length, RL)， 然 后 根 據 公 式 (RLAl24 h- RLAl0 h)/(RLCK24 h- RLCK0 h) × 100% 計算相對根長。

1.2.2 柱花草根系總 RNA 提取和 cDNA 合成

參照 TRIzol(Invitrogen Inc，美國)方法提取鋁處理下TPRC2001-1根系總RNA：取0.1 g根系樣品加入 1 mL TRIzol提取液，充分研磨后加入 0.2 mL氯仿。室溫放置 5 min 后，4 ℃，12 000 r·min-1離心15 min。吸取上清，加入0.5 mL異丙醇，充分混勻后室溫放置 10 min。4 ℃，12 000 r·min-1離心10 min 后，棄上清，用 75 % 乙醇洗滌沉淀。4 ℃，7 500 r·min-1離心 5 min 后，棄上清，風干沉淀，加入DEPC水溶解RNA。

參照M-MLV反轉錄試劑盒(Invitrogen Inc，美國)方法合成cDNA第一鏈：在PCR管中加入2 μg RNA、 1 μL Oligo(dT)18(100 nmol·μL-1)， 并 加 入ddH2O 補足體積至 10 μL。于 70 ℃ 保溫 5 min，冰浴 5 min。隨后分別加入 5 μL M-MLV 5 × Reaction Buffer，1.25 μL dNTPs(10 mmol·L-1)，0.5 μL RNase 抑制劑 (25 U)和 1 μL M-MLV RT(200 U)。于 42 ℃ 反應 60 min，70 ℃ 滅活 10 min。反應結束后，-20 ℃保存備用。

1.2.3SgSTOPs全長 cDNA 克隆

參考柱花草鋁毒脅迫轉錄組結果[18]，篩選獲得SgSTOP1和SgSTOP2基因全長序列，根據基因序列，設計引物SgSTOP1-TL-F和SgSTOP1-TL-R,SgSTOP2-TL-F和SgSTOP2-TL-R(表1)。以根系cDNA為模板，通過PCR擴增SgSTOP1和SgSTOP2基因。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測、目的片段回收、連接到克隆載體pEASY-T1(Takara公司)、轉化大腸桿菌DH5α和測序分析后，獲得SgSTOP1和SgSTOP2全長cDNA序列，并將序列提交至NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)。SgSTOP1和SgSTOP2在NCBI上的序列號分別為MH795120和MH-795121)。

1.2.4 生物信息學分析

運用DNAMAN進行多序列比對分析；利用WoLF PSORT(https://www.genscript.com/wolf-psort.html)進行亞細胞定位預測分析；利用OCTOPUS(http://octopus.cbr.su.se/index.php)預測跨膜結構域和信號肽；采用MAGA(v5.05)進行系統進化樹分析；采用MEME在線軟件(http://meme-suite.org/)進行蛋白Motif分析；利用NCBI網站進行保守結構域分析。

1.2.5 實時熒光定量 PCR 分析

運用SYBR Green(Takara，日本)定量試劑盒進行實時熒光定量PCR，用Rotor-Gene 3000系統(Corbett Research，澳大利亞)進行反應。定量PCR反應體系為：10 μL 2 × SYBR Green PCR master mix，6.4 μL Mili-Q 水 ，0.8 μL 10 μmol·L-1的引 物 ，2 μL 稀 釋100 倍的 cDNA 模板。反應程序為：95 ℃ 30 s，94 ℃15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40 次循環。相對表達量=目的基因表達量/看家基因(SgEF-1a)表達量，目的基因SgSTOP1、SgSTOP2和看家基因SgEF-1a的定量引物如表1所列。

1.3 數據統計分析

采用 Microsoft Excel 2003 進行作圖，用 SPSS19.0(SPSS Institute，美國)軟件對數據進行統計分析，用平均值±標準誤表示測定結果，對鋁處理下不同柱花草基因型間進行單因素方差分析，對基因在根和葉、CK和鋁處理間分別進行t檢驗分析。

2 結果與分析

2.1 鋁毒對柱花草相對根長的影響

60 μmol·L-1AlCl3處理顯著抑制柱花草根系生長，并且，柱花草的耐鋁能力表現出基因型差異。在 60 μmol·L-1鋁處理下，柱花草 TPRC2001-1 的相對根長最大，顯著大于其他7份基因型(P＜0.05)；TF268和TF305次之，TF323最小(圖1)。這表明，8份試驗材料中TPRC2001-1是耐鋁柱花草基因型。

2.2 柱花草SgSTOP1和SgSTOP2的克隆與序列分析

根據轉錄組測序結果[18]，獲得SgSTOP1和SgSTOP2基因序列，設計正向和反向引物，以鋁毒脅迫下TPRC2001-1根系cDNA為模板，擴增出SgSTOP1和SgSTOP2基因cDNA全長序列。經測序分析發現，SgSTOP1和SgSTOP2基因全長序列與轉錄組結果一致，基因大小分別為 1 515、1 077 bp(圖 2)。SgSTOP1和SgSTOP2分別編碼504、358個氨基酸殘基，蛋白分子量分別為56.2和39.7 kDa，理論等電點分別為5.78、5.76，均為親水性蛋白質。此外，利用在線軟件OCTOPUS預測分析發現，SgSTOP1和SgSTOP2均無跨膜結構域和信號肽。利用WoLF PSORT預測分析發現，SgSTOP1和SgSTOP2均定位于細胞核中，表明SgSTOP1和SgSTOP2具備作為轉錄因子的特點。

圖 2 SgSTOP1 和 SgSTOP2 全長 cDNA 克隆Figure 2 Full length cloning of SgSTOP1 and SgSTOP2

2.3 柱花草 SgSTOP1 和 SgSTOP2 多序列比對和蛋白保守結構域分析

CDD Tools預測表明，SgSTOP1和SgSTOP2屬

圖 3 SgSTOP1 和 SgSTOP2 保守結構域預測Figure 3 Conserved domain prediction of SgSTOP1 and SgSTOP2

于ZF-C2H2家族成員，兩者分別含有2個Zn綁定位點，2個核酸綁定位點(圖3)。將SgSTOP1和SgSTOP2蛋白序列與已報道的不同物種STOPs進行多序列比對分析，發現SgSTOP1和SgSTOP2與其他物種STOPs同源性較高。并且，SgSTOP1和SgSTOP2與其他同源蛋白均具有4個鋅指結構域，其中，SgSTOP1的鋅指結構均為C2H2型，而SgSTOP2具有3個C2H2型鋅指結構域和1個C2HC型鋅指結構域。此外，STOPs蛋白在鋅指結構域部分較保守，而N端或C端同源性均較低(圖4)。

圖 4 SgSTOP1 和 SgSTOP2 與其他 STOPs同源蛋白氨基酸比對分析Figure 4 Multiple alignment analysis of SgSTOP1 and SgSTOP2 with homologous plants

2.4 系統進化樹分析

系統進化樹分析表明，STOPs蛋白可以被分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ共 3類群 (圖 5)。柱花草 SgSTOP1和SgSTOP2同屬第Ⅲ類群。其中，SgSTOP1與赤小豆VuSTOP1屬同一分枝，相似性最高，達75.9%，而SgSTOP2與水稻ART1、擬南芥AtSTOP2和高粱SgSTOP1b同源性最高。此外，運用MEME軟件進行蛋白Motif預測分析，發現STOPs蛋白包含 16個保守 Motifs(圖 5)。SgSTOP1和 SgSTOP2均含有完整的Motif1(ZF-C2H2結構域)，表明兩者均屬于鋅指蛋白家族成員，可能具有轉錄調控功能。

圖 5 SgSTOP1和SgSTOP2與其他STOPs同源蛋白系統進化樹及Motif分析Figure 5 Phylogenetic tree and Motif analysis of SgSTOP1 and SgSTOP2 with other STOP proteins

2.5 SgSTOP1和 SgSTOP2基因表達模式分析

本研究進一步對SgSTOP1和SgSTOP2的表達模式進行分析。結果表明，在正常生長條件下，SgSTOP1和SgSTOP2在根和葉中均有表達，且SgSTOP1在葉部的表達量高于根部，而SgSTOP2在根部的表達量高于葉部(圖6A)。相比對照(CK)，鋁處理(Al)顯著增強了SgSTOP1基因在根部和葉部中的表達，但對SgSTOP2基因在根部和葉部的表達均無顯著影響(圖6B、C)。

圖 6 柱花草 SgSTOP1 和 SgSTOP2 基因的表達分析Figure 6 Expression analysis of SgSTOP1 and SgSTOP2 genes

3 討論與結論

鋁毒是酸性土壤中限制作物生長的主要因素之一，不同植物或基因型對鋁毒害忍耐能力不一樣[20]。起源于熱帶和亞熱帶地區的植物被認為對酸性土壤鋁毒害具有較強的適應性[21]。研究表明，柱花草具有較強的耐鋁毒害能力，但表現出基因型差異，其中，柱花草TPRC2001-1耐鋁毒能力與水稻“XN1”相當[20]。本研究比較了8份柱花草基因型耐鋁能力差異，發現TPRC2001-1的相對根長顯著高于其他7份材料，進一步表明TPRC2001-1是耐鋁柱花草基因型(圖1)。在此基礎上，本研究在TPRC 2001-1中克隆了柱花草鋅指轉錄因子SgSTOP1和SgSTOP2基因 (圖 2)。

近年來，對C2H2型鋅指轉錄因子STOPs功能研究較為廣泛，STOPs基因在植物耐鋁毒害中起重要作用[6, 8, 22]。在擬南芥中，具有 2 個 STOPs，在大豆(Glycine max)中，具有3個STOPs，在水稻中，具有1個STOPs的同源蛋白OsART1，在高粱中，具有4個STOPs[22-24]。STOPs轉錄因子具有高度保守的C2H2鋅指結構域，該結構域由23～27個氨基酸殘基組成，含有兩個保守的半胱氨酸和組氨酸殘基[7]。在本研究中，SgSTOP1和SgSTOP2蛋白均屬于鋅指蛋白家族成員，兩者的氨基酸序列均包含4個鋅指結構(圖3、圖4)，并且亞細胞定位預測其可能與其他物種STOPs相似，定位于細胞核中。

系統進化樹分析表明，柱花草SgSTOP1和SgSTOP2同屬第Ⅲ類群，所在類群包括已被證明具有轉錄調控功能STOPs蛋白，如AtSTOP1、LjSTOP1和NtSTOP1等，它們是耐鋁毒脅迫的重要基因[13, 25]。其中，SgSTOP1與調控赤小豆(Vigna umbellata)VuSTOP1相似性最高。研究表明，VuSTOP1具有轉錄激活功能，能調控檸檬酸轉運蛋白VuMATE1的表達，從而增強赤小豆的耐鋁性[26]。SgSTOP2與高粱SbSTOP1b同源性最高。Huang等[22]研究發現，SbSTOP1b定位于細胞核中，與SbSTOP1d形成異源二聚體發揮轉錄活性功能，從而調控SbSTAR2和SbMATE的表達。此外，SgSTOP1和SgSTOP2蛋白序列與其他物種STOPs類似，均包含保守的C2H2鋅指結構域 Motif1(圖 5)，表明 SgSTOP1和SgSTOP2是典型的鋅指結構蛋白，可能具有調控下游基因表達的功能。

已有研究表明，鋁毒脅迫能夠調控植物STOPs基因的表達。如在擬南芥和大豆中，AlCl3處理后，根中AtSTOP1和GmSTOP1的表達量均顯著增加[8, 27]。在赤小豆中，Al3+和 H+均能誘導VuSTOP1基因的表達[26]。在高粱(Sorghum bicolor)中也發現了類似的結果，AlCl3處理能誘導4個SbSTOP1基因的表達[22]。但是，Yamaji等[10]研究發現，OsART1基因表達不受Al3+影響，但 Al3+能增強OsART1下游調控基因OsSTAR1和OsSTAR2的表達，表明OsART1基因在RNA水平上不受Al3+的調控，Al3+可能在蛋白水平上影響OsART1轉錄活性，進而調控下游基因的表達。在本研究中，鋁毒脅迫顯著增強SgSTOP1在根和葉中的表達，但鋁毒脅迫對SgSTOP2在根和葉中的表達影響不明顯(圖6)，結果暗示了SgSTOP1在轉錄水平上能響應鋁毒脅迫，而SgSTOP2可能與直系同源基因OsART1相似，在轉錄水平不受Al3+影響，其功能仍需做進一步研究論證。

綜上所述，本研究克隆了柱花草SgSTOP1和Sg STOP2基因。亞細胞預測發現，SgSTOP1和SgSTOP2均定位于細胞核中，兩者均為ZF-C2H2家族成員，均含有4個鋅指結構域。系統進化樹分析發現，SgSTOP1與赤小豆VuSTOP1同源性最高，SgSTOP2與高粱SbSTOP1b同源性最高。鋁毒處理顯著增強SgSTOP1基因在柱花草根和葉中的表達，暗示其參與了柱花草應答鋁毒脅迫的過程。為此，后續研究將對SgSTOP1和SgSTOP2的亞細胞定位、基因功能，基因與柱花草耐鋁毒能力的相關性進行深入分析，這將有助于進一步揭示柱花草適應鋁毒脅迫的分子調控機制。