褪黑素預處理提高多年生黑麥草抗旱性的機理分析

李本峰，杜紅梅

（上海交通大學設計學院，上海 200240）

水資源短缺已成為全球共同面對的難題，通過一定的方法和手段來提高植物的抗旱性不僅可以有效應對水資源短缺的問題，還有利于植物的生產和推廣。多年生黑麥草(Lolium perenne)是一種優質的牧草和草坪草，但由于需水量大，抗旱性差，影響了多年生黑麥草在生產中的推廣和應用。因此，采用一定的措施提高多年生黑麥草的抗旱性，并分析其抗旱性提高的機理，具有重要的意義。褪黑素(melatonin, MT)是一種色胺類小分子物質[1-2]。現已證明，所有的高等植物、低等植物和植物的主要器官，如花、葉和果實等都含有MT[3]。MT在植物中的主要作用是調節植物的生長發育、維持細胞膜的穩定性、抑制葉綠素的分解和提高機體的抗氧化能力等[2]。

關于MT在草坪上的應用研究，Shi等[4]利用不同濃度的MT預處理狗牙根(Cynodon dactylon)，再進行脅迫處理，發現 20 μmol·L-1的 MT 溶液顯著提高了狗牙根對于鹽脅迫、干旱脅迫和冷脅迫的抗性，這可能與MT處理顯著降低了脅迫后期的活性氧含量，提高了過氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)的活性，并且上調了與氮代謝、碳水化合物代謝、三羧酸循環相關的基因的表達有關。在干旱脅迫下，隨著細胞失水，植物會主動積累一些滲透調節物質，以維持滲透平衡，減少脅迫損傷。這些滲透調節物質主要是小分子化合物，包括氨基酸、有機酸和糖等。近年來，許多技術，例如氣相色譜(gas chromatography,GC)、液相色譜、高分辨率的核磁共振和質譜(mass spectrometry, MS)技術，已經被成功用于干旱脅迫條件下差異代謝產物的分析。在這些方法中，GC-MS不僅簡單，而且分辨率高[5]。關于干旱脅迫條件下，MT處理對多年生黑麥草過氧化脅迫以及代謝產物積累的影響，以及與多年生黑麥草抗旱性的關系，未見報道。通過前面試驗發現，MT預處理對多年生黑麥草的抗旱性有顯著影響，其中 25、50、75 μmol·L-1MT 溶液在干旱脅迫前連續澆灌3 d，可以顯著提高多年生黑麥草的抗旱性 ， 但 25、 50、 75 μmol·L-1處 理 之 間 無 顯 著 差異[6]。因此本研究選取 25 μmol·L-1MT 溶 液 預 處理，從過氧化清除機制以及代謝產物積累角度，分析MT預處理提高多年生黑麥草抗旱性的可能機制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及生長條件

選用北京克勞沃種子公司提供的進口多年生黑麥草品種‘百靈鳥'(千粒重為2.3 g)。將草種均勻撒播于直徑16 cm、深14 cm、底部帶有出水口的塑料花盆中，每盆播種1g，播種基質體積比為2∶1的園土和河沙，每立方米基質混入1 kg的復合肥 (N∶P∶K=15∶6.5∶8.3)。發芽后，置于上海交通大學農業與生物學院農業工程訓練中心的溫室大棚內培育60 d，溫室白天溫度為15～25 ℃，夜晚溫度為15 ℃，相對濕度為60%～80%，光照強度為600μmol·(m2·s)-1。生長過程中，每周修剪2次，留茬高度為6 cm，澆水2次，澆至有水從排水口中排出為止。每周澆1次1/2Hoagland's營養液，每次每盆澆150 mL。然后移至人工氣候箱(HP1000GS型，武漢瑞華儀器設備有限責任公司)內，適應7d后開始試驗處理，氣候箱內溫度為 (25±1)℃/(20±1)℃(晝溫/夜溫)，相對濕度60%，光周期14h，光照強度 320 μmol·(m2·s)-1。

1.2 試驗方法

選取長勢一致的黑麥草，隨機分為4組，每組重復4次，每盆1個重復，開始進行褪黑素處理，對照和處理的MT溶液澆灌量均為100 mL。褪黑素處理期間，為了保證干旱處理和對照的一致性，停止澆灌Hoagland's營養液，并按照留茬高度，對不同處理統一進行修剪。

對照處理（CK）∶以 0 μmol·L-1MT 溶液連續澆灌3 d后，開始正常的灌水；處理MCK：以25 μmol·L-1MT溶液連續澆灌3d后，進行正常的灌水；處理 D：以0μmol·L-1MT 溶液連續澆灌3d后，停止灌水，開始干旱處理；處理MD：以25μmol·L-1MT溶液連續澆灌3d后，開始干旱處理。干旱處理11 d后復水。在干旱處理的0、4、11d和復水后的第1天，取多年生黑麥草的倒數第2片葉測定相關指標，丙二醛(Malondialdehyde,MDA)、抗氧化酶活性以及代謝產物分析的樣品凍存在-80 ℃冰箱中。

1.2.1 褪黑素溶液的配置

稱取 0.232 g MT，溶解至 5 mL 100% 的酒精中，再加入去離子水，定容至 250 mL，配成 4 mmol·L-1的 MT 母液，再用去離子水稀釋成 25 μmol·L-1的MT溶液。同時加入 0.05% (V∶V)的吐溫-20 ℃[7]。

1.2.2 相關生理指標的測定

草坪質量 (turf quality, TQ)用來評價草坪草的總體質量表現[8]，具體從草坪草顏色、均一性、密度和質地來評定，采用9分制。0分代表死亡、干枯的草坪草；9分代表綠色、緊致、完美的草坪草；6分代表草坪質量可以接受。光化學效率(photochemical chemical efficiency)， 即 光 系 統 II最大光化學量子產量，是可變熒光與最大熒光的比值，用Fv/Fm來表示。將材料放在暗室中暗適應30 min后，采用雙通道調制葉綠素熒光儀(Dual-PAM-100, 德國 WALZ公司)的熒光成像系統，利用DualPAM軟件對整盆植株進行熒光成像，取所有像素點的均值作為該盆植株的Fv/Fm[9]。葉片的相對 含 水 量 (relative water content, RWC)采 用 Barrs和Weatherley[10]描述的方法進行測定。采用Blum和Ebercon[11]的方法，用不同處理時間葉片的電解質外率 (electrolyte leakage, EL)表示相對電導率的大小。

1.2.3 丙二醛和抗氧化酶活性測定

將凍存的多年生黑麥草樣品0.25 g液氮研磨后，采用pH 7.8的磷酸緩沖液提取，低溫離心后，上清液用于可溶性蛋白、MDA含量和抗氧化酶活性分析。可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍G-250染色法測定[12]。采用硫代巴比妥酸法，測定不同處理條件下葉片中的MDA的含量[13]。SOD活性測定參照Giannopolitis和Ries[14]的方法進行。SOD酶活性的表示方法為，吸光度560 nm條件下，抑制NBT光還原50%為一個酶活性單位。CAT和 POD活性測定參照 Chance和 Maehly[15]、Du等[16]的方法進行，CAT活性的表示方法為吸光度每分鐘變化1視為一個酶活性單位，POD活性的表示方法為吸光度每分鐘變化0.1視為一個酶活性單位。

1.2.4 代謝產物的提取、分離和定量

將凍存的葉片樣品0.1 g置于研缽中，加入適量的液氮研磨成凍干粉，待液氮完全揮發，分次加入3 mL 80%甲醇提取液研磨成勻漿，轉入到10 mL 的離心管中，再加入 30 μL 2 mg·mL-1的核糖醇，充分振蕩后，70 ℃ 水浴 20 min，然后 5 000 g離心 10 min，吸取 1.5 mL 上清液至 10 mL 離心管中，再加入1.4 mL蒸餾水和0.75 mL氯仿，充分振蕩后，吸取上清液1.6 mL至HPLC管中，濃縮(LNGT88臺式快速離心濃縮干燥器，太倉市華美生化儀器廠)干燥。濃縮干燥后加入 80 μL 15 mg·mL-1甲氧胺吡啶，密封置于30 ℃恒溫箱中甲氧基化1.5 h。甲氧基化結束后，加入 80 μL BSTFA∶TMCS(99∶1)，80 μL 吡啶，70 ℃ 硅烷化 1 h。

GC-MS方法根據Qiu等[17]的方法并稍加修改。硅烷化后的樣品用美國安捷倫公司7890-5975型GCMS 聯用儀進行分析。色譜柱為 DB-5MS (30 m ×0.25 mm × 0.25 μm)。不分流進樣，進樣量 1 μL。GC進樣口溫度260 ℃，穩定5 min。色譜柱起始溫度 80 ℃，樣品注入 2 min 后色譜柱溫度以 5 ℃·min-1的速度上升到 280 ℃。離子源溫度200 ℃。載氣為氦氣，載氣流速 1 mL·min-1。溶劑延時 3 min，電子碰撞電離電壓70 eV，質譜全掃描范圍(m/z∶30-550)進行檢測。

GC-MS分析得到的總離子流色譜圖，采用安捷倫公司NIST 2011譜庫進行檢索。使用核糖醇作為內標，計算代謝產物的相對含量。

1.3 數據統計及分析

試驗采用完全區組設計。應用SPSS軟件，在P= 0.05的水平上，采用Fisher's最小顯著差數法對試驗結果進行統計分析。文章中的圖采用SigmaPlot 10.0 軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 對多年生黑麥草草坪質量、光化學效率和葉片相對含水量的影響

在干旱處理4 d時，干旱處理組草坪草的TQ顯著下降 (P＜0.05)，處理至 11 d 時，TQ 繼續下降，而在復水后干旱處理組的TQ上升。與不加MT的處理相比，干旱處理條件下，25 μmol·L-1的 MT 溶液預處理顯著增加了多年生黑麥草的TQ(圖1)。與TQ的變化趨勢一致，長時間的干旱脅迫顯著影響了多年生黑麥草的Fv/Fm和RWC(P＜0.05)，而在干旱脅迫條件下，25 μmol·L-1的 MT 溶液預處理顯著抑制了干旱脅迫對多年生草坪草Fv/Fm和RWC的

影響。復水后，25 μmol·L-1的 MT 溶液預處理又顯著促進了Fv/Fm和RWC的上升(P＜0.05)，與干旱處理組相比，25 μmol·L-1的 MT 溶液預處理后，復水后Fv/Fm和RWC分別增加了54.85%和125.36%。

2.2 對多年生黑麥草細胞膜穩定性和丙二醛含量的影響

電解質外滲的增加一般被認為是植物細胞膜受到破壞的結果。干旱脅迫條件下，多年生黑麥草葉片的EL值顯著增加(P＜0.05)，尤其是在干旱脅迫 11 d 時，而 25 μmol·L-1的 MT 溶液預處理顯著抑制了干旱脅迫條件下EL值的上升(P＜0.05)。在干旱脅迫4 d和11 d時，與干旱處理組相比，25 μmol·L-1的 MT溶液預處理后，EL值分別下降27.02%和13.89%。而在復水后，與干旱處理組相比，25 μmol·L-1的 MT 溶液預處理后 EL 值顯著降低 (P＜0.05)，比對照組下降了 56.50%(圖 2)。MDA是衡量細胞膜過氧化的重要指標。干旱脅迫導致了多年生黑麥草葉片中MDA積累，而MT處理一定程度上減少了葉片中MDA的積累。在干旱脅迫11 d和復水1 d后，與干旱處理組相比，MT處理顯著降低了葉片中MDA的含量(P＜0.05)，分別降低了58.85%和65.08%(圖2)。

圖 2 褪黑素溶液預處理對多年生黑麥草葉片電解質外滲和丙二醛含量的影響Figure 2 Effect of melatonin pretreatments on electrolyte leakage and malondialdehyde content in the leaves of perennial ryegrass (Lolium perenne)

2.3 對多年生黑麥草抗氧化相關酶活性的影響

25 μmol·L-1MT 溶液預處理顯著影響了干旱脅迫條件下多年生黑麥草抗氧化相關酶的活性。干旱脅迫4 d時，與未干旱處理相比，干旱處理組多年生黑麥草的 SOD 活性顯著增加 (P＜0.05)。11 d的干旱脅迫導致了SOD活性顯著下降(P＜0.05)；

復水 1 d ，SOD 活性回升。在干旱脅迫 4 d、11 d和復水1 d時，MT預處理均顯著增加了多年生黑麥草的 SOD 活性 (P＜0.05)(圖 3)。干旱處理組的CAT 活性在 4 d 和 11 d 時顯著下降 (P＜0.05)，25 μmol·L-1MT溶液預處理顯著抑制了干旱脅迫下CAT 活性的下降 (P＜0.05)。復水 1 d 后，干旱處理后的CAT活性的變化不明顯，而MT處理組的CAT活性比干旱處理組增加了126.17%(圖3)。干旱處理4 d顯著增加了多年生黑麥草的POD活性(P＜ 0.05)。 與 對 照 相 比 ， 11 d 的 干 旱 脅 迫 對POD 活性沒有顯著影響 (P＞0.05)。在 4 d 和 11 d 干旱脅迫下，與未添加MT的干旱處理相比，MT預處理均顯著增加了葉片中的POD活性(P＜0.05)。復水 1 d 后 POD 活性顯著增加 (P＜0.05)，與對照相比，干旱脅迫條件下，不添加MT和MT預處理后，POD活性分別增加56.59%和146.79%(圖3)。

圖 3 褪黑素溶液預處理對多年生黑麥草超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和過氧化物酶活性的影響Figure 3 Effect of 25 μmol·L-1 melatonin pretreatment on the superoxide dismutase, catalase and peroxidase activities of perennial ryegrass (Lolium perenne)

2.4 對多年生黑麥草代謝產物積累的影響

采用 GC-MS 的方法，從干旱脅迫 4 d、11 d 和復水后1 d的葉片中篩選出100種化合物。其中，有機酸占30%，氨基酸占24%，糖醇類占30%，其他化合物占16%。采用偏最小二乘判別分析(Partial least squares-discriminate analysis, PLS-DA)的方法分析了MT處理對干旱脅迫條件下多年生黑麥草代謝產物積累的影響，結果表明，灌溉和干旱處理組可以很好的分離，而隨著處理時間的延長，CK和MCK兩組之間的差異減少。與灌溉相比，在干旱脅迫條件下，MT對代謝產物積累的影響比較大，尤其是在11 d和復水1 d的情況下。這與生理指標以及抗氧化酶的分析結果一致(圖4)。

圖 4 褪黑素溶液預處理對多年生黑麥草干旱脅迫 4 d、11 d和復水1 d葉片中代謝物總量變化的偏最小二乘判別分析Figure 4 Partial least squares-discriminate analysis of the metabolic profiles of leaves of perennial ryegrass (Lolium perenne) after 4 days (A) and 11 days (B) of drought stress and after 1 day of rewater with 25 μmol·L-1 melatonin pretreatment

根 據 變 異 權 重 系 數 (Variable importance in the projection, VIP)，選擇VIP大于1的代謝產物重點關注。表1、表2和表3分別為干旱脅迫4 d、11 d以及復水1 d時葉片中VIP值大于1的代謝產物列

表 1 干旱脅迫4 d多年生黑麥草氣相色譜-質譜檢測化合物相對含量Table 1 The relative levels of metabolites identified by gas chromatography-mass spectrometry of perennial ryegrass (Lolium perenne) after 4 days of drought stress

表 2 干旱脅迫11 d多年生黑麥草氣相色譜-質譜檢測化合物相對含量Table 2 The relative levels of metabolites identified by gas chromatography-mass spectrometry in perennial ryegrass (Lolium perenne) after 11 days of drought stress

表。在干旱脅迫 4 d、11 d 和復水 1 d，分別篩選出VIP大于1的代謝產物40種(表1)、36種(表2)和35種(表3)。和灌溉的對照相比，計算關鍵化合物相對含量的變化，計算方法為(處理的相對含量-CK相對含量)/CK相對含量 × 100%。同時，以相對含量變化幅度大于50%或小于50%，MCK和MD有相同的變化趨勢，篩選MT影響多年生黑麥草抗旱性的關鍵代謝產物。在干旱脅迫4 d時，篩選出8種代謝產物，分別是谷氨酸、葡萄糖胺、脯氨酸、纈氨酸、赤蘚糖醇、異亮氨酸、2-氨基庚二酸和葡萄糖(表1)。在干旱脅迫11 d時，篩選出4種代謝產物，分別是亮氨酸、奎寧酸、丙氨酸甲酯和天冬酰胺(表2)。在復水1 d時，篩選出8種代謝產物，分別是乙二醇、琥珀酸、赤蘚酮糖、糠醇、鳥氨基、異亮氨酸、甘氨酸和尿素(表 3)。

表 3 復水1 d多年生黑麥草氣相色譜-質譜檢測化合物相對含量Table 3 The relative levels contents of metabolites identified by gas chromatography-mass spectrometry in perennial ryegrass(Lolium perenne) after 1 day of rewater after drought stress

3 討論與結論

3.1 改善抗旱相關生理指標，提高抗氧化酶活性，提高多年生黑麥草的抗旱性

25 μmol·L-1MT 溶液預處理可以顯著增加干旱脅迫條件下多年生黑麥草的TQ(P＜0.05)，也有利于復水后TQ的回升，提高干旱脅迫條件下多年生黑麥草的品質。Fv/Fm是衡量植物光合效率的重要指標，在本研究中觀察到，25 μmol·L-1MT 溶液預處理顯著提高了干旱脅迫和復水后多年生黑麥草的Fv/Fm(P＜0.05)，有利于維持葉片正常的光合作用，提高多年生黑麥草對干旱的抗性。葉片RWC是評估植物內部水分含量和水分缺失程度的重要指標。與Fv/Fm的變化趨勢一致，MT預處理有利于降低干旱脅迫對葉片RWC的影響。干旱脅迫致使植物細胞發生脂質過氧化，產生MDA，破環細胞膜的結構，導致細胞液和離子外滲，提高植物組織的相對電導率[18]。在本研究中，在干旱脅迫4 d和11 d，都觀察到干旱處理組EL值和MDA含量的顯著上升(P＜0.05)，但MT預處理顯著抑制了EL值和MDA含量的上升速率(P＜0.05)。而復水后，MT處理又有利于細胞膜結構的修復。說明，25 μmol·L-1MT 溶液預處理能夠維持干旱脅迫條件下多年生黑麥草細胞膜的穩定性。

干旱脅迫會導致植物組織中活性氧的積累，破壞細胞的結構，影響細胞的代謝[19]。而SOD是清除超氧陰離子(O2·-)的特異性酶[20]。干旱脅迫4 d時，干旱處理組SOD活性的增加可能是一種特異性的誘導反應，以清除過量的O2·-。而在 11 d 和復水1 d時，干旱處理組SOD的活性顯著下降(P＜0.05)，這可能是由于長期的干旱脅迫導致SOD部分失活，但 25 μmol·L-1MT 預處理顯著增加了干旱脅迫和復水后SOD的活性(P＜0.05)。CAT是一種重要的 H2O2清除酶，干旱脅迫 4 d和 11 d，25 μmol·L-1MT 預處理顯著抑制了 CAT 活性的下降速率 (P＜0.05)。而復水 1 d，MT 預處理又顯著促進了CAT活性的增加(P＜0.05)。POD可以分解細胞內H2O2、胺類和酚類等有害物質。在本研究中，干旱脅迫導致多年生黑麥草POD活性顯著上升(P＜0.05)，而 25 μmol·L-1MT 預處理顯著增加了干旱脅迫條件下多年生黑麥草POD酶活性的上升幅度 (P＜0.05)。綜上所述，25 μmol·L-1MT 預處理通過提高干旱脅迫條件下多年生黑麥草SOD、CAT、POD活性，增加細胞活性氧的清除能力，維持細胞膜系統的穩定性，提高光化學效率，延緩葉片的衰老，增強細胞的保水能力，從而提高多年生黑麥草的抗旱性。

3.2 提高滲透調節物質的表達，提高多年生黑麥草的抗旱性

氨基酸是蛋白質的重要組成成分，在植物的代謝過程中具有不可替代的作用，同時很多氨基酸含量的高低與植物非生物脅迫抗性具有一定的相關性。在本研究中總計檢測到24種氨基酸，與MT作用相關的氨基酸有8種，其中，脯氨酸、異亮氨酸和鳥氨基含量的變化最明顯。與干旱對照相比，25 μmol·L-1MT 預處理 4 d 提高了脯氨酸的相對含量，而脯氨酸在植物的滲透調節、自由基清除和維持細胞膜的穩定等與植物抗性相關的功能中具有重要作用[21]，這一結果也與相關的生理指標相對應。異亮氨酸是重要的支鏈氨基酸，干旱條件下，豌豆(Pisum sativum)[22]、小麥(Triticum aestivum)擬南芥(Arabidopsis thaliana)的葉片中都發現了異亮氨酸的積累。MT處理條件下，異亮氨酸的含量增加，可能和能量代謝有關[23]。鳥氨酸是脯氨酸生物合成的前體，在復水1 d，鳥氨酸的積累可能和脯氨酸的代謝有關(表3)。

受MT影響，含量發生顯著變化的有機酸主要是奎寧酸和2-氨基庚二酸。奎寧酸是一種重要的滲透調節物質，已有的研究表明，西班牙栓皮櫟(Quercus suber)自然干旱[24]和北美黑楊(Populus deltoides)人為干旱條件下[25]，奎寧酸的含量顯著增加。奎寧酸參與苯丙氨酸代謝[26]。在本研究中，MT預處理條件下，奎寧酸積累可能和苯丙氨酸的高表達有關(結果未顯示)。干旱脅迫下，Carmo-Silva等在狗牙根和結縷草(Zoysia japonica)的葉片中也發現了2-氨基庚二酸[27]，而關于2-氨基庚二酸的生理功能以及與MT處理的關系，未見報道。

干旱脅迫影響糖和糖醇的表達。在本研究中，MT預處理后，含量變化最顯著的是赤蘚酮糖。在對照以及干旱脅迫條件下，MT預處理都增加了赤蘚酮糖的含量。赤蘚酮糖是糖酵解的中間產物，赤蘚糖醇是赤蘚酮糖的前體。赤蘚酮糖也是維生素C的降解產物之一[28]，而在MT影響下，赤蘚酮糖積累的原因還有待進一步分析。MT預處理顯著增加了灌溉和干旱條件下尿素和葡萄糖胺的含量。Shi等[4]也發現了干旱脅迫前用MT預處理顯著增加尿素的含量。尿素的積累可能主要是用于多胺類物質的合成。Naeem等[29]發現了干旱脅迫條件下，鷹嘴豆(Cicer arietinum)葉片中的葡萄糖胺下降。而關于MT預處理影響葡萄糖胺積累的生理機制，還有待進一步分析。

綜上所述，25 μmol·L-1褪黑素預處理可能主要通過提高干旱脅迫條件下多年生黑麥草異亮氨酸、脯氨酸、鳥氨基、奎寧酸、2-氨基庚二酸、赤蘚酮糖、尿素和葡萄糖胺等相關代謝產物的積累，增強多年生黑麥草的滲透調節能力和抗氧化能力等，進而提高多年生黑麥草的抗旱性。