一株巨菌草內生生防菌的分離、鑒定及其基因組測序分析

宋昭昭，賈雨雷，黃在興，林標聲,3，梅 蘭，林占熺

（1. 福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002；2. 國家菌草工程技術研究中心，福建 福州 350002；3. 龍巖學院生命科學學院，福建 龍巖 364012）

巨菌草(Pennisetum giganteumsp.)屬于禾本科狼尾草屬多年生植物，其分蘗速度快、根系發達、葉面積寬[1]，莖粗可達3.5 cm、株高最高可達708 cm，適宜在熱帶、亞熱帶栽培，已推廣到巴布亞新幾內亞、馬來西亞、盧旺達、萊索托、南非、埃及及我國福建、廣西和海南等地種植[2]。巨菌草為典型的C4植物，其營養豐富，纖維、粗蛋白、糖分等含量高、適口性好、根系發達、生物量大等[2-3]，因此不僅廣泛應用于栽培食藥用菌[4]、生態脆弱區的治理與修復[5]，同時還可用于發電、生產沼氣及乙醇、造紙等領域[6-8]。是一種具有較強應用價值的能源草、生態草。

生物防治是使農業可持續發展的重要途徑之一，內生菌(Endophyte)作為生防菌是近年來研究的熱點[9]。內生菌是寄生在健康植物組織內、但不引起植物組織明顯病害癥狀的一類微生物，包括真菌、細菌、放線菌及古細菌等多種微生物類群[10]。其作為生防資源在一定程度上可以減少對環境的污染。內生菌對其寄主植物起到生防作用主要通過4個主要途徑：產生抗生素；競爭生態位和營養；誘導寄主產生系統抗性和促進植物生長[11]。關于植物內生菌在防治病害、促進植物生長發育、固氮方面等的作用，國內外均有一定研究[12]。其中，內生鏈霉菌的研究主要集中在水稻(Oryza sativa)、生姜(Zingiber officinale)、牛筋草(Eleusine indica)、檉柳(Tamarix chinensis)、香蕉(Musa paradisiaca)等植物上，但對巨菌草的內生菌研究卻鮮有報道。

玉蜀黍平臍蠕孢(Bipolaris maydis)是引起禾本科植物玉米小斑病 (Corn southern leaf blight)的一種非專性寄生病原菌。該病菌引起的玉米小斑病是世界玉米種植區一種重要的葉部病害[13]，玉米小斑病在中國玉米主產區每年都有不同程度的發生，個別年份甚至猖獗流行，可引起玉米(Zea mays)葉片過早干枯，輕者降低千粒重，重者導致果穗腐爛、種子發黑、發芽率降低，嚴重影響玉米的產量和品質[14]。目前，對玉米小斑病的防治主要為化學防治和選育抗病品種等手段，但效果較差。近年來，隨著綠色農業的發展，采用內生菌拮抗玉蜀黍平臍蠕孢成為了防治玉米小斑病的一個重要研究方向。

本研究從巨菌草中分離出一株對玉蜀黍平臍蠕孢有抑菌活性的巨菌草內生菌，采用Illumina Miseq第二代測序技術對其基因組序列進行測序分析，以期為該菌株的功能基因組學研究提供基礎數據，為深入研究該菌株在生物防治方面的作用及其遺傳多樣性提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

在國家菌草工程技術研究中心試驗基地采集健康的巨菌草根、莖稈、葉片樣本，樣本采集后立即清洗干凈，帶回實驗室處理。

植物病原菌: 玉蜀黍平臍蠕孢由福建農林大學國家菌草工程技術研究中心從多年栽培的巨菌草患病葉片中分離保存，傳代培養采用PDA培養基(土豆 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH自然)，28 ℃ 培養 3 d。

1.2 方法

1.2.1 內生拮抗菌株分離

樣品用無菌水沖洗，75%酒精和2%次氯酸鈉分別消毒1和5 min，無菌水沖洗3～5次。每100 mg樣品與1 mL無菌水混合，充分研磨，進行10-2，10-3，10-4，10-5濃度梯度稀釋，各取 100 μL 分別涂布于PDA培養基、LB培養基(胰蛋白胨10 g，酵母提取物 5 g，NaCl 10 g，瓊脂 20 g，水 1 L，pH 7.2)、高氏一號培養基 (可溶性淀粉 20 g，硝酸鉀 1 g，磷酸氫二鉀 40.5 g，硫酸鎂 0.5 g，氯化鈉 0.5 g，硫酸亞鐵 0.01 g，瓊脂 20 g，水 1 L， pH 7.2)上，28 ℃

培養3～5 d，挑取具有不同形態特征的菌落，經多次平板劃線純化后，4 ℃保存備用。

對內生菌抑菌活性的初篩、復篩采用對峙法[15]。初篩出優良菌株進行復篩，每個處理3個重復。數據處理使用DPS數據處理軟件。

1.2.2 內生拮抗菌株的菌株鑒定

形態特征和培養特征：參照《鏈霉菌鑒定手冊》[16]，利用細菌微量生化鑒定管對菌株JK7-2進行生理生化鑒定。

16S rDNA的序列分析：使用快速無毒DNA提取試劑盒(高提取量型)(福州麥力生物科技有限公司)提取基因組DNA，以此為模板，使用27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGG TTACCTTGTTACGACTT-3')通用引物進行16S rRNA基因PCR。產物送上海生工測序。利用NCBI (National Center for Biotechnology Information)(www.ncbi.nih.gov/BLAST/)搜索其同源基因，采用DNAMAN進行序列同源性比對分析，采用MEGA7.0 軟件構建 NJ (neighbor joining)分子系統進化樹。

1.2.3 內生拮抗菌株的基因組測序和分析

使用 MOBIO PowerSoil? DNA Isolation Kit按照操作步驟提取基因組DNA，經瓊脂糖凝膠電泳、Nanodrop檢測和Qubit檢測DNA質量。將純化的基因組DNA經Covaris破碎儀隨機打斷成長度為300 bp小片段，經末端修復和加A尾后在片段兩端連接接頭制備DNA文庫。

庫檢合格后，利用 Illumina HiSeq PE150高通量測序平臺對該生防菌株DNA文庫進行進行基因組測序。采用spade程序對去除接頭序列的測序數據進行從頭拼接，基因組序列基本評估,對拼接的數據進行評價。選取大于200 bp的 scaffold序列進行后續分析。采用Velvet 1.2.10組裝軟件進行序列組裝，運用原核基因組注釋工具prokka[17]對菌株基因組進行注釋，并與GO，COG，KEGG等數據庫進行比對分析。其中蛋白編碼基因的GO注釋采用根據Pfam的結果通過Pfam2go[18]軟件來完成；蛋白編碼基因的COG的注釋采用blast軟件來完成；蛋白編碼基因的Pathway注釋采用KEGG的KAAS自動化注釋系統完成。通過對蛋白編碼基因進行功能注釋和分類，從而獲得菌株基因組功能注釋信息。

2 結果和分析

2.1 拮抗菌的篩選

從巨菌草根、莖、葉中分離到45株菌株。經過復篩得到10株抑菌率大于10%的菌株(表1)，抑菌效果最好的菌株為JK7-2，抑菌率為28.57%，其發酵液對玉蜀黍平臍孺孢有強烈的抑制作用(圖 1)。

表 1 內生菌對玉蜀黍平臍孺孢的抑菌效果Table 1 Inhibition effect of endophytes to Bipolaris maydi

圖 1 菌株JK7-2發酵液的抑菌試驗Figure 1 Bacteriostasis experiment of strain JK7-2 with fermentation broth

表 2 菌株JK7-2對碳源的利用情況Table 2 Utilization of carbon source by strain JK7-2

2.2 拮抗菌的菌株鑒定

菌株JK7-2在高氏一號培養基上生長豐茂，菌落為淺灰色，氣生菌絲發達，革蘭氏染色為陽性。顯微鏡下觀察，孢子絲直，柔曲，松敞螺旋形。部分生理生化特征鑒定結果如表2所列，菌株JK7-2能夠利用葡萄糖、果糖、麥芽糖、半乳糖等碳源，但不能利用乳糖、棉籽糖、甘露醇和木糖等碳源。將本結果同《鏈霉菌鑒定手冊》上不同種菌株進行比對，并結合JK7-2在培養基上形態及顯微鏡下觀察結果，可初步判定為鏈霉菌屬(Streptomycessp.)。

對JK7-2菌株進行16S rDNA序列測定，測序結果在NCBI數據庫進行blast比較，利用軟件MEGA7對菌株JK7-2的16S rDNA序列與同屬的其他菌株的16S rDNA進行序列比對，構建系統進化樹(圖2)結果表明，菌株 JK7-2 與菌株Streptomycessp. SIIA 2050位于同一系統發育分支上，結合其生理生化特性和培養特征，該菌株屬于鏈霉菌屬的鏈霉菌。

2.3 基因組組裝與注釋

原始測序數據結果表明，菌株JK7-2基因組中有 5 207 939個原始讀數 (raw reads)，總堿基數為781 190 850。經過序列拼接得到77個骨架(scaffold)，其中 40個大于 1 000 bp，GC含量為73.17%，序列長度為 8 818 289 bp。預測該菌株其編碼 7 432 個基因，基因總長度為 7 654 773 bp，編碼基因占基因組百分比為86.80%。將測序原始數據上傳至NCBI數據庫，獲得SRA BioProject Accession(生 物 工 程 ID)： PRJNA451251(alias:ERR1216363)。

2.4 Streptomyces sp. JK7-2蛋白質COG聚類分析

基于原核基因組注釋工具 prokka對細菌基因組進行注釋的基因預測結果表明，菌株JK7-2共預測得到7 432個基因，通過COG數據庫進行blast比對分析(E-value＜1E-10)，成功獲得COG功能注釋的有6 677個蛋白基因(圖3)。主要為一般功能預測、轉錄相關、碳水化合物運輸與代謝、氨 基酸運輸與代謝、能源生產和轉換、次級代謝產物合成等。

圖 2 基于菌株JK7-2及其他鏈霉菌屬菌株的16S rDNA序列構建的NJ進化樹Figure 2 NJ evolution tree constructed from strain JK7-2 and other 16S rDNA sequences of Streptomyces strains

圖 3 菌株JK7-2的蛋白質COG聚類分析Figure 3 Protein COG cluster analysis of strain JK7-2

將預測基因的蛋白序列與GO數據庫進行比對獲得GO注釋信息，蛋白編碼基因的GO注釋采用根據Pfam的結果通過Pfam2go軟件來完成。GO注釋包括基因的分子功能、參與的生物學過程、所處的細胞位置。如圖4所示，共有8 758個基因成功獲得GO功能注釋。在生物學過程方面，主要與代謝過程(1 434個)、單組織過程、細胞內過程、和定位有關；在細胞組分方面，主要與膜(608個)、細胞(127個)、細胞部分和細胞器有關；在分子功能方面，主要與催化活性(1 817個)、結合(1 150個)、核酸結合轉錄因子的活性和轉運活性有關。

2.5 KEGG代謝通路分類

根據KEGG對該菌株分析得知，菌株基因組共有1 611個基因得到注釋。糖代謝、氨基酸代謝以及膜運輸為菌株基因組最主要涉及的幾種代謝通路，分別有222個、219個和133個基因注釋結果(圖5)。進一步通過KEGG PATHWAY數據庫分析發現，菌株JK7-2有354個與抗生素合成有關通路得到注釋。此外還發現20個鏈霉素和5個四環素已及17個青霉素等抗生素產生通路相關的基因。

3 討論與結論

鏈霉菌屬原核生物界放線菌目鏈霉菌科具有絲狀分支菌絲的革蘭氏陽性細菌[19]，廣泛分布于土壤、海洋、極端環境及一些生物體內[20]。該屬的大多數成員能產生在醫療、農業、生物防治等領域具有重要意義的天然次級代謝物[21]。較土壤放線菌而言，植物內生放線菌研究較少且所處生境特殊，成為新菌株和天然活性化合物的新來源，在促生、抑制病蟲害等方面具有廣闊應用前景[22]。鏈霉菌能利用拮抗作用抑制其他植物病原微生物，其作用機制一般包括拮抗作用、競爭作用和誘導植物抗性作用等[23]。鏈霉菌可通過產生抗生素等多種活性物質，來抑制病原菌的生長和繁殖，在生物防治和環境保護領域具有廣闊應用前景。

DNA是生命遺傳信息的載體，但是，遺傳信息和生命功能的體現卻主要由蛋白質來完成，因此，蛋白質編碼基因的功能注釋是微生物全基因組分析的核心內容。通過對蛋白質編碼基因的功能進行注釋，才能對該物種的生命活動在分子的水平上有所認識[24]。本研究采用Illumina HiSeq第二代高通量測序技術對分離自巨菌草的具有抗病 原真菌特性的鏈霉菌菌株JK7-2進行基因組測序，從JK7-2菌株基因功能注釋結果來看，COG數據庫的比對結果顯示轉錄相關、碳水化合物運輸與代謝、氨基酸代謝是菌株主要的功能預測結果，值得注意的是，該菌株與次級代謝產物合成相關基因有349個，擁有這么多的次級代謝產物合成基因極有可能是該菌株產生多種生物抗菌活性物質的主要原因；通過GO數據庫的比對，代謝過程、膜、催化活性等注釋結果呈現出較高的相關性；利用KEGG數據庫中的代謝通路分析手段，確定了菌株主要代謝通路的組成，發現多個與鏈霉素、青霉素和四環素產生等代謝通路相關的基因。根據這些信息，初步推測該菌株具有一定的抗生素代謝功能，為今后該菌株代謝功能，生物防治功能的探究奠定了基礎。

圖 4 菌株JK7-2 的GO功能歸類Figure 4 GO functional classification of strain JK7-2

圖 5 菌株JK7-2 的KEGG功能歸類Figure 5 KEGG functional classification of strain JK7-2

抗生素是非常重要的一類來源于微生物次級代謝產物的藥物。農用抗生素不僅可直接開發作為農藥防治農作物的病蟲草害，而且還為化學農藥的創制提供了先導化合物[25]。鏈霉菌屬是公認的抗生素和次級代謝產物主要來源，本研究通過對JK7-2基因進行預測，獲得了多個抗生素和次級代謝產物合成基因，為相關化合物的合成機制研究提供數據。

本研究從巨菌草內分離出了一株內生菌JK7-2，通過形態特征、生理生化反應及16S rDNA序列分析結果將其鑒定為鏈霉菌，通過發酵液抑菌試驗得知，該菌株對玉米小斑病菌有良好的抑制作用，這對開發新型綠色安全的抗微生物制劑和生物農藥具有重要意義。本研究的相關結果將為Streptomycessp. JK7-2 的功能基因組學研究及相關次級代謝產物的生物合成途徑研究提供幫助；同時從分子生物學的角度初步探究了該菌株的生長代謝及抑菌功能機制，為今后巨菌草內生鏈霉菌生物防治相關機制研究的深入開展提供了重要的數據參考。