LC-MS導向分離山殼骨中主成分及其生物活性研究

吳浩祥, 袁捷, 肖文靜, 陳錦蘭

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LC-MS導向分離山殼骨中主成分及其生物活性研究

吳浩祥1, 袁捷2*, 肖文靜2, 陳錦蘭2

(1. 廣州中醫藥大學第一附屬醫院, 廣州 510405; 2. 廣州中醫藥大學中醫藥數理工程研究院, 廣州 510006)

為了解山殼骨()的化學成分和生物活性，運用LC-MS聯用技術分離得到羽扇豆醇(1)和豆甾醇(2)。體外活性評價結果表明，化合物1和2均具有中等的抗MRSA活性，但不具有神經保護作用。這是首次對山殼骨進行化學成分和生物活性研究，為綜合開發與利用山殼骨提供科學依據。

山殼骨；LC-MS；羽扇豆醇；豆甾醇

爵床科(Acanthaceae)為泛熱帶分布的大科，在我國主要分布于長江以南的各省份，以云南分布最多[1–2]。本科植物種類繁多，《中國植物志》記載我國有68屬300多種，形態多樣，有喬木、灌木、草本和藤本等；分布范圍廣，森林、荒漠、郊野、甚至紅樹林均有分布，故一直被認為屬于研究難度大的科[1–3]。爵床科多種植物可供藥用，其中不少為知名中藥材，如板藍()、穿心蓮()、尖藥花()、槍刀藥()、九頭獅子草()等；當中的穿心蓮更是祛熱解毒、消炎止痛之良藥，對細菌性與病毒性上呼吸道感染及痢疾有特殊療效，被譽為天然抗生素藥物[4]。目前，以穿心蓮為主要原料，已有多個廣泛應用于臨床的中成藥，如穿心蓮內酯片、炎琥寧、穿琥寧等[5]。可見，爵床科植物具有明顯藥用價值，明星藥材“穿心蓮”更是被制作成多種中成藥用于治療多種疾病，且效果顯著。據此，天然藥物化學家們對爵床科植物的研究產生了巨大興趣，并致力于該科植物的化學成分與生物活性研究。

山殼骨屬()約有60~100種植物，分布于泛熱帶，亞洲約20種，其中我國暫有8種[3]。目前，國內對山殼骨屬植物的化學成分與生物活性研究尚屬空白，因此對該屬植物進行系統的化學成分及生物活性研究，發掘擁有潛在藥理活性的品種，具有重要科學意義。山殼骨()隸屬山殼骨屬植物，產于廣東(徐聞)、海南(保亭、儋州)、廣西(龍州)、云南(西雙版納)[3]。本研究對山殼骨的化學成分與生物活性進行研究，運用LS- MS聯用技術快速分離鑒定山殼骨的主要化學成分，并對獲得的化學成分進行生物活性評價, 旨在發掘山殼骨的藥用價值，彌補山殼骨研究的空白,同時為綜合開發與利用山殼骨提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 儀器、試劑和耗材

質譜：Waters 3100 SQDMS (低分辨ESI)；核磁共振譜：Bruker Avance III 500型核磁共振儀，以氘代試劑殘留溶劑峰為內標；液相色譜與質譜聯用儀：Waters 2695 LC偶聯Waters Acquity ELSD、Waters 3100 SQDMS；分析色譜柱型號：Waters Sunfire?RP C-18，3.5m, 4.6 mm×100 mm；CO2細胞培養箱(上海力申科學儀器有限公司)；垂直超凈工作臺(上海智城分析儀器制造有限公司)；低速離心機(科大創新股份有限公司中佳分公司)；MK3型酶標儀(美國Thermo Fisher公司)；超低溫冰箱(日本三洋SANYO公司)；FM-500型倒置熒光生物顯微鏡(上海普丹光學儀器有限公司)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)。

Cell Counting Kit-8 (CCK-8)細胞增殖-毒性檢測試劑盒(日本同仁化學研究所)；Greiss NO試劑盒(碧云天生物技術研究所)；MTT噻唑蘭(美國Sigma公司)；叔丁基過氧化氫(t-BHP)(成都格雷西亞化學技術有限公司)；200~300、300~400目柱層析硅膠均為青島海洋化工廠生產；TLC預制薄層板: HSGF254為德國Merck公司生產；葡聚糖凝膠Sephadex LH-20 (Pharmacia Biotech AB、Uppsala、Sweden); MCI樹脂：CHP20P (75~150m), Mitsubishi Chemical Corporation生產；96孔細胞培養板(美國CORNING公司)；胎牛血清(FBS) (澳大利亞Gibco公司)；青-鏈霉素(P/S)(Thermo公司)；DMEM培養基(美國Gibco公司)；RPMI-1640培養基(德國Biological Industries公司)；DMSO溶液(美國Sigma公司); HPLC分析用乙腈(Merck公司); 實驗用水由美國Millipore公司純水、超純水系統提供；其他有機溶劑均為國產分析純產品；TLC顯色劑為5%香蘭素乙醇液。

1.2 材料

山殼骨()全株15 kg, 2018年4月，采集于廣東省揭陽市，標本號為20180401。

1.3 細胞株

神經細胞株：人神經母細胞瘤SH-SY5Y；購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。

細菌細胞株：金黃色葡萄球菌CMCC26003、大腸桿菌ATCC8739和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MASA JCSC4474；購自廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

1.4 LC-MS分析條件

分析儀器：Waters 2695-2998-2424-3100SQDMS;色譜柱：Waters Sunfire?RP C18, 3.5m, 4.6 mm×100 mm；HPLC梯度：色譜乙腈-0.005%三氟乙酸/去離子水-0.005%三氟乙酸梯度洗脫，起始濃度5%色譜乙腈-0.005%三氟乙酸，結束濃度95%色譜乙腈-0.005%三氟乙酸；運行時間25 min；流速：1 mL min–1。

1.5 LC-MS導向分離

山殼骨(15 kg)，粉碎后用95%工業酒精室溫浸泡3次，每次5 d，合并提取液，減壓濃縮至無乙醇味。將得到的總浸膏用水懸浮，然后用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮萃取液，得到水部分(205 g)和乙酸乙酯部分(85 g)。

運用LS-MS聯用技術，對獲得的水部分(205 g)和乙酸乙酯部分(85 g)進行分析。水部分化合物的保留時間集中在0~2 min，提示為大極性類化合物(圖1: A)。質譜分析結果顯示，保留時間R=1.91 min的化合物分子量為180，推導為葡萄糖；而保留時間R≈ 1.29 min的化合物分子量在質譜上響應不明顯，結合其大極性特點，推導為無機鹽類成分。據此，本研究將不對山殼骨提取物水部分進行深入研究。

乙酸乙酯部分主要化合物的保留時間集中在26.14 min (圖1: B)。隨后對保留時間R=26.14 min的色譜峰進行質譜分析，該色譜峰存在著2個分子量(426、412)，揭示其包含2個化合物。據此，本研究選擇對山殼骨提取物乙酸乙酯部分進行深入研究，分離鑒定R=26.14 min的主要化合物。選用MCI柱層析處理乙酸乙酯部分，以乙醇-水(50%、70%、95%乙醇)為流動相梯度洗脫，富集R=26.14 min的化合物，根據其弱極性特征，該類化合物將富集在95%乙醇的洗脫組分中(組分A)。

隨后，采用硅膠柱層析(200~300目)對組分A進行處理，正己烷:乙酸乙酯[10∶1~1∶1, (/, 下同)]梯度洗脫，薄層色譜(TLC)檢測合并，獲得子組分A1~A3。子組分A2經凝膠柱層析處理，氯仿∶甲醇(1∶1)洗脫，得到組分B2A~B2C；接下來對得到的子組分B2B再進行硅膠(300~400目)柱層析處理，正己烷∶乙酸乙酯(10∶1~1∶1)洗脫，最后獲得化合物1 (18 g)和2 (15 g)(圖2)。

1.6 結構鑒定

化合物1 白色粉末;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H2.36 (1H, m, H-19), 4.56 (1H, s, Ha-29), 4.68 (1H, s, Hb-29), 1.67 (3H, s, H-30);13C NMR (125 MHz, CDCl3):C38.6 (C-1), 27.3 (C-2), 78.9 (C-3), 40.0 (C-4), 55.2 (C-5), 18.0 (C-6), 34.2 (C-7), 40.8 (C-8), 50.4 (C-9), 37.1 (C-10), 20.88 (C-11), 25.0 (C-12), 38.0 (C-13), 42.8 (C-14), 27.9 (C-15), 35.5 (C-16), 42.9 (C-17), 48.2 (C-18), 47.9 (C-19), 151.0 (C-20), 29.7 (C-21), 38.8 (C-22), 27.3 (C-23), 15.4 (C-24), 15.9 (C-25), 16.1 (C-26), 14.5 (C-27), 18.2 (C-28), 109.3 (C-29), 19.2 (C-30)。以上數據與文獻[6]報道的一致，故鑒定為羽扇豆醇。

化合物2 白色粉末;1H NMR (500 MHz, CDCl3):H0.68 (3H, s, H-18), 1.01 (3H, s, H-19), 0.93 (3H, d,= 6.7 Hz, H-21), 0.80 (3H, d,= 6.7 Hz, H- 27), 0.82 (3H, t,= 7.2 Hz, H-29), 0.84 (3H, d,=6.7 Hz, H-26), 5.35 (1H, m, H-6), 5.14 (1H, dd,= 15.1, 8.7 Hz, H-22), 5.02 (1H, dd,= 15.1, 8.7 Hz, H- 23), 3.53 (1H, m, H-3);13C NMR (125 MHz, CDCl3):C37.4 (C-1), 29.2 (C-2), 71.8 (C-3), 42.4 (C-4), 140.7 (C-5), 121.7 (C-6), 31.7 (C-7), 32.0 (C-8), 50.2 (C-9), 36.6 (C-10), 21.2 (C-11), 39.9 (C-12), 42.4 (C-13), 56.9 (C-14), 24.4 (C-15), 29.2 (C-16), 56.7 (C-17), 11.8 (C-18), 18.7 (C-19), 39.9 (C-20), 19.0 (C-21), 138.3 (C-22), 129.2 (C-23), 51.4 (C-24), 32.0 (C-25), 21.0 (C-26 ), 21.2 (C-27), 21.3 (C-28), 12.4 (C-29)。以上數據與文獻[6]報道的一致，故鑒定為豆甾醇。

圖2 化合物1和2的結構

1.7 生物活性篩選

體外神經保護活性篩選 將SH-SY5Y細胞以6×109L–1的密度接種于經多聚賴氨酸包被過的培養皿中，加入含有10% FBS和1% P/S的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。每天全量換液1次，隔天傳代，并在顯微鏡下觀察。將SH- SY5Y細胞以6×105L–1的密度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，每孔100L。將細胞分為0 (正常組)、50、100和200mol L–1的t-BHP組，每組6個復孔。待細胞融合度達到80%~90%時，吸凈培養基，加入含有相應濃度t-BHP的培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中分別培養3、6、12和24 h，觀察SH- SY5Y細胞衰老情況。將SH-SY5Y細胞以6×109L–1的密度接種于多聚賴氨酸包被的96孔板中，每孔100L。將細胞分為正常組、模型組、給藥組(含有25、50、100和200g mL–1大葉紫金牛酚的模型組)，每組6個復孔。置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h, 觀察化合物1、2對SH-SY5Y細胞衰老的保護情況。MTT法檢測各組SH-SY5Y細胞的存活率。

體外抗MRSA(耐甲氧西林金黃色葡萄球菌)活性篩選 本實驗使用96孔板梯度稀釋技術，測定化合物的最低抑菌濃度。首先將7.5 mL的指示劑溶液(100g mL–1的刃天青水溶液)與5 mL的待測菌溶液(1.25×106cfu mL–1)混勻，并向第1至第8列的所有測試孔中各加入100L混合菌液。然后將20L待測樣品的DMSO溶液和80L混合菌液加入到第1列的各個板孔中，均勻混合后取出100L的溶液轉移到第2列相應的板孔中，并用同樣的方法倍增稀釋到第8列。最后，將加好樣品的孔板放入到恒溫培養箱，37℃培養10~12 h。菌液變紅色為無抑菌活性，藍色為有抑菌活性，菌液維持藍色的最低稀釋濃度被認為是待測化合物的最低抑菌濃度,每個樣品做2組并重復測定3次。陽性對照為萬古霉素(vancomycin)。

2 結果和討論

2.1 體外神經保護活性評價

現代研究表明神經細胞保護是防治神經退行性疾病，如老年性癡呆、重癥抑郁癥、帕金森癥和中風等疾病的重要機制[7–10]。評價并篩選出具有顯著神經保護活性的化合物，對開發治療神經退行性疾病藥物至關重要。因此，本研究通過探討化合物1、2是否可以延緩SH-SY5Y細胞衰老，評價化合物1、2是否具有神經保護作用。試驗結果表明, 化合物1、2與模型組相比，不能延緩SH-SY5Y細胞衰老，因此在SH-SY5Y模型下，化合物1、2不具有神經保護作用。

2.2 體外抗MRSA活性評價

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant，MRSA)被稱為“超級細菌”, 已成為全球院內感染的首要致病菌，與HBV、HIV并列成為世界范圍的三大難題[11–15]。MRSA具有多重耐藥性，對-內酰胺等幾乎所有臨床常用抗生素表現出耐藥性；萬古霉素曾一度被認為是治療MRSA感染的首選抗生素，但該抗生素毒副作用大，長期大劑量使用對腎臟損害嚴重，容易造成耳聾[16–19]。因此，尋找新的能抑制MRSA的抗生素迫在眉捷。

本研究評價了化合物1、2對革蘭氏陰性菌(大腸桿菌ATCC8739)、革蘭氏陽性菌(金黃色葡萄球菌CMCC26003)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA JCSC4474)的抑制活性。從表1可知，化合物1、2均對MRSA JCSC4474表現出中等抑制活性，MIC值為50g mL–1。

表1 化合物1和2的體外抑菌活性

本研究首次對爵床科山殼骨植物進行化學成分和生物活性研究，運用LC-MS聯用技術快速分離山殼骨中主要化學成分，并使用核磁共振波譜技術進行結構解析，鑒定為羽扇豆醇(1)和豆甾醇 (2)。同時本研究評價了化合物的體外神經保護以及抗MRSA活性，試驗結果揭示這些化合物具有中等抗MRSA活性但不具有神經保護作用，為綜合開發與利用山殼骨提供科學依據。

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LC-MS Guided Isolation of Chemical Constituents fromand Their Biological Activities

WU Hao-xiang1, YUAN Jie2*, XIAO Wen-jing2, CHEN Jin-lan2

(1.The First Affiliated Hospital, Guangzhou University of Chinese Medicine,Guangzhou 510405, China; 2. Mathematical Engineering Academy of Chinese Medicine, Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China)

In order to study the chemical constituents fromand their biological activities, two main compounds were isolated from the EaOAc fraction and identified as lupeol (1) and stigmasterol (2) by using LC-MS guided isolation.activity screening, all these compounds showed moderate anti-MRSA activities but no neuroprotective effects. This is the first report about the chemical constituents fromand their biological activities, which would provide scientific basis to the development and utilization of.

; LC-MS; Lupeol; Stigmasterol

10.11926/jtsb.4020

2018-11-22

2018-12-20

廣東省中藥新藥研發重點實驗室開放運行費(2017B030314096)資助

This work was supported by the Open Operation Cost of Guangdong Provincial Key Laboratory of New Drug Development and Research of Chinese Medicine (Grant No. 2017B030314096).

吳浩祥，男，博士，研究方向為中藥新藥研發。E-mail: gzwhx2010@163.com

E-mail: yuanjie@gzucm.edu.cn