大黃素甲醚通過調控miR-21表達抑制乳腺癌細胞生存、促進其凋亡

白 潔，英子偉，趙 林，李偉杰，王 聰，謝賢鑫，姜大慶

0 引言

近年來，隨著以手術治療為基礎的化療、放療及靶向治療的發展，乳腺癌的復發率及病死率有下降趨勢，但是并沒有突破性進展[1-3]。靶向治療及中藥單劑的開發是未來乳腺癌綜合治療的重要研究內容。中藥大黃中的單劑，如大黃素，對乳腺癌、胃癌及肺癌等腫瘤細胞具有抑制增殖、促進凋亡的作用。大黃素甲醚是大黃的組分之一，其對肝癌及胰腺癌等惡性腫瘤細胞具有殺傷作用[4-5]。miR-21在乳腺癌中為高表達，對乳腺癌細胞增殖具有促進作用，對凋亡具有抑制作用，其作用靶基因包括PDCD4、TPM1及PTEN等[6]。目前還沒有大黃素甲醚對乳腺癌細胞增殖及凋亡的作用及機制研究。本研究通過觀察大黃素甲醚對乳腺癌細胞的作用，為乳腺癌的中藥單劑治療提供研究基礎，為大黃素甲醚在惡性腫瘤中應用的進一步研究提供試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料 人乳腺癌細胞株(HCC1937、MCF-7)購自中科院上海細胞庫，在中國醫科大學腫瘤醫院中心實驗室培養傳代。大黃素甲醚(CAS No：521-61-9)標準品購自成都瑞芬思生物科技有限公司。PDCD4多克隆抗體購自美國Sigma公司。RT-PCR逆轉錄試劑盒購自立陶宛Fermentas公司，miRNA提取分離試劑盒、All-in-OneTMqPCR Mix試劑盒及MTT試劑盒購購自美國Abcom公司。引物由大連寶生生物技術有限公司進行設計及合成，miR-21 forward：5′-CGTATGTGAGTCTTCAGCTG-3′；reverse：5′-TTTGTCTGAGGGCACAACTC-3′。GAPDH forward：5′-GGAAGTGGGAATCGGAGTC-3′；reverse：5′-GAATAGGGATGTGATGGTTC-3′。試驗組為給予大黃素甲醚、miR-21 mimics或miR-21 inhibitor干預的細胞組，對照組為未給予干預細胞組。

1.2 CCK-8法檢測轉染后細胞增殖 收集培養14 d的乳腺癌細胞按10∶1效靶比混合，加入96孔板，另設靶細胞和單獨效應細胞組，每組設5個復孔，放置37 ℃、5%CO2孵箱中培養48 h，每孔加CCK8 10 μl，37 ℃ 孵育4 h，用酶標儀在450 nm處測OD值，計算大黃素甲醚干預后細胞存活率。

1.3 流式細胞術檢測細胞凋亡 取轉染48 h對數期乳腺癌細胞，按照Annexin V-FITC/PI雙染色凋亡檢測試劑盒說明書操作步驟進行操作，采用流式細胞儀檢測細胞凋亡，Cell Quest軟件進行結果分析，以早期凋亡及晚期凋亡陽性細胞的百分比例之和作為凋亡率進行統計分析，實驗重復3次。

1.4 qRT-PCR 取乳腺癌細胞，依照Trizol試劑盒操作說明書進行總RNA提取及純化，紫外吸收法檢測RNA質量。應用變性瓊脂糖凝膠電泳方法對RNA完整性進行測定。合成樣品cDNA、進行梯度稀釋標準品和待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量PCR、進行制備繪制梯度稀釋標準曲線DNA模板，實時定量PCR進行待測基因的檢測，將配制好的PCR反應溶液置于Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。ΔΔCt法對溶解曲線進行分析。

1.5 Western blot 對乳腺癌細胞株進行預處理后定量蛋白濃度。采用蛋白裂解液裂解蛋白后震蕩及搖勻，抽提總蛋白，提取上清液，BCA定量試劑盒定量蛋白濃度。10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，電轉移至PVDF膜。5%脫脂奶粉于室溫條件下封閉90 min后加入一抗，孵育過夜后加入二抗，再次孵育后采用化學發光法顯色，β-actin為內參照。采用QuantityOne分析灰度值，結果表示為蛋白相對表達量=目標蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值。

1.6 miR-346 mimics或inhibitor轉染乳腺癌的細胞 對數生長期乳腺癌細胞消化為單細胞的懸液，以20×104/孔的細胞數接種到24孔板中，依照Lipo2000說明書步驟對融合高于70%的細胞株轉染，轉染完成后改為含10%胎牛血清培養基繼續培養，48 h后以qRT-PCR檢測轉染效率進行下一步實驗。

2 結果

2.1 大黃素甲醚對乳腺癌細胞存活率的作用 CCK-8檢測顯示，與空白對照組對比，給予不同濃度梯度(0.5、5、50、500 μg/ml)大黃素甲醚培養48 h的HCC1937、MCF-7乳腺癌細胞的細胞存活率均下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1A、圖1B；經5 μmol/L濃度大黃素甲醚處理的HCC1937及MCF-7乳腺癌細胞在培養48、72、96 h細胞存活率均下降，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖1C、圖D。

2.2 大黃素甲醚對乳腺癌細胞凋亡的作用 流式細胞術檢測顯示，與空白對照組對比，分別給予不同濃度梯度(0.5、5、50、500 μg/ml)大黃素甲醚培養48 h的HCC1937、MCF-7乳腺癌細胞凋亡率均升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3 大黃素甲醚對miR-21調控作用 qRT-PCR檢測顯示，與空白對照組比較，分別給予5 μg/ml大黃素甲醚干預的HCC1937及MCF-7細胞miR-21表達下降，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3A。Western blot檢測顯示，與空白對照組比較，給予5 μg/ml大黃素甲醚干預的HCC1937、MCF-7細胞PDCD4蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3B。Western blot檢測顯示，與陰性對照組比較，給予miR-21 mimics干擾的HCC1937、MCF-7細胞PDCD4蛋白表達降低，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖3C。給予miR-21 inhibitor干擾的HCC1937、MCF-7細胞PDCD4蛋白表達升高，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3D。

3 討論

在乳腺癌治療方面，隨著靶向藥物及化療的發展，生存期也在延長，但其病死率及復發率并沒有得到明顯改善[2]。中藥單劑抗腫瘤的研發是目前進展期乳腺癌治療的熱點方向。中藥單劑具有殺傷腫瘤細胞、減少化療藥物應用劑量及化療增效作用，并能夠減少化療不良反應[7]。大黃素甲醚是植物大黃中的重要組分之一，作為大黃的復合成分，用于抗炎、導瀉及抗腫瘤治療，在抗腫瘤方面，具有阻斷細胞周期、抑制細胞增殖及促進凋亡的作用[8]。微小miR-21在乳腺癌發生發展中發揮重要作用，對乳腺癌細胞的增殖、凋亡及侵襲具有調控作用[9]。有研究顯示，大黃素甲醚的靶點包括EMMPRIN、miR370、DNMT等[10]。本研究對大黃素甲醚在乳腺癌細胞中的作用與miR-21的靶向調節機制進行了觀察。

圖1 CCK-8試驗檢測

注：A.不同濃度梯度大黃素甲醚培養48 h的HCC1937細胞存活率，B.不同濃度梯度大黃素甲醚培養48 h的MCF-7細胞存活率，C.經5 μmol/L濃度大黃素甲醚處理的HCC1937細胞存活率，D.經5 μmol/L濃度大黃素甲醚處理的MCF-7細胞存活率

圖2 流式細胞術檢測不同濃度梯度大黃素甲醚培養48 h后HCC1937細胞(A)、MCF-7細胞(B)凋亡率

圖3 兩組HCC1937、MCF-7細胞miR-21、PDCD4蛋白表達比較

注：A.qRT-PCR檢測大黃素甲醚干預的HCC1937、MCF-7細胞miR-21表達；B.Western blot檢測大黃素甲醚干預的HCC1937、MCF-7細胞PDCD4蛋白表達；C.Western blot檢測給予miR-21 mimics干擾的HCC1937、MCF-7細胞PDCD4蛋白表達；D.Western blot檢測給予miR-21 inhibitor干擾的HCC1937、MCF-7細胞PDCD4蛋白表達

本研究結果顯示，給予不同濃度梯度大黃素甲醚培養48 h的HCC1937及MCF-7乳腺癌細胞的細胞存活率下降，經大黃素甲醚處理的HCC1937及MCF-7乳腺癌細胞在培養48、72、96 h的細胞存活率均下降。結果表明，大黃素甲醚對乳腺癌細胞具有殺滅作用，并具有劑量、時間依賴性。本研究進一步顯示，給予不同濃度梯度大黃素甲醚培養48 h的HCC1937、MCF-7乳腺癌細胞凋亡率均升高，表明大黃素甲醚對乳腺癌細胞凋亡具有促進作用。Hong等[11]研究顯示，大黃素甲醚誘導乳腺癌MDA-MB-231細胞停留在G0/G1期，從而促進其凋亡，抑制其增殖。本研究在HCC1937及MCF-7乳腺癌細胞中得出的結論與其相同。本研究進一步顯示，給予大黃素甲醚干預的HCC1937及MCF-7細胞miR-21表達降低，PDCD4蛋白表達升高，表明大黃素甲醚可能對miR-21及PDCD4蛋白表達具有調控作用。給予miR-21 mimics干擾的HCC1937及MCF-7細胞PDCD4蛋白表達降低，而給予miR-21 inhibitor干擾的HCC1937及MCF-7細胞PDCD4蛋白表達升高，表明PDCD4可能是miR-21的靶蛋白，大黃素甲醚通過調控miR-21表達，介導PDCD4蛋白表達，對乳腺癌細胞增殖及凋亡進行調控。Venturutti等[12]研究顯示，上調miR-21表達引起PDCD4表達水平降低，PDCD4是miR-21的靶蛋白。Frankel等[13]研究顯示，PDCD4是miR-21重要的靶基因，miR-21通過調控PDCD4表達從而介導乳腺癌細胞增殖、凋亡及遷移等惡性行為。Han等[14]研究認為，大黃素甲醚通過調控轉錄因子SOX2表達抑制直腸癌SW620細胞的轉移行為。Chen等[15]研究認為，大黃素甲醚通過下調EMMPPRIN表達誘發結腸癌細胞的凋亡。李燕等[4]研究認為，大黃素通過調節miR-370表達從而對AMPK/SP1/DNMT1信號通路進行調控，誘導肝癌細胞凋亡。以上結果均表明，大黃素甲醚可以對靶基因進行調控，從而介導下游通路的生物學功能，影響腫瘤細胞的增殖及凋亡等惡性行為。

綜上所述，大黃素甲醚對乳腺癌細胞具有殺傷作用，這種作用是通過miR-21介導的PDCD4通路實現的，但其作用機制仍有待于進一步研究。