一種利用活性炭提取中藥材DNA的方法

盧 雪,陳 蓉,杜 鳳,唐 卓*

1中國科學院成都生物研究所 天然產物中心，成都 610041；2中國科學院大學，北京 100049

目前中藥材的質量鑒定多用性狀鑒別、顯微鑒別、理化鑒別等方法進行，在實際操作中這些方法卻有許多不足之處。按照現行的國家藥典標準，性狀和顯微鑒別很難區別相似種，化學法多測定中藥材中一種或幾種化學成分，但是很多化學成分并不是該中藥材所獨有，在其常見偽品及其相似種中也存在，因此該方法很難真正對中藥材的質量進行控制。在如今的藥材市場中，有些不法商家對多種中藥尤其是貴重中藥材進行摻假[1]，給傳統中醫的發展帶來了極大的挑戰。近幾年發展起來的中藥材DNA分子鑒定的方法，由于其對物種能夠快速、準確地識別和鑒定，成為鑒別中藥材的重要手段之一[2,3]。

要進行DNA分子鑒定，DNA的提取是極其重要、不可或缺的一個步驟。當前DNA的提取多采用商業試劑盒，但是商業試劑盒價格較貴，步驟多，對于提取大量樣品的DNA來說，操作較為繁瑣。因此，開發一種簡易提取藥材中DNA的方法尤為重要。在本文中，我們開發了一種快速、操作簡單的DNA提取方法：采用實驗室常見易得的NaCl溶液作為裂解液，并在其中加入一定量的活性炭粉末，在高溫下進行裂解，直接取裂解液即可作為PCR模板進行檢測。

1 實驗材料

1.1 材料

藏紅花(購自上海崇西西紅花種植合作社)；半夏、槐米、三七花、甘草(購自四川御民堂大藥房有限責任公司)。

1.2 儀器與試劑

主要儀器：PCR儀(博日，TC-96/G/H(b)c)，實時熒光定量PCR儀(Thermo,5100),凝膠成像分析儀(Typhoon FLA7000)，顯微鏡(Nikon，Eclipse-E200)，恒溫儀(MS-100)，旋渦混合器(其林貝爾，GL-888)，調速迷你離心機(上海生工，Super Mini Dancer)。

主要試劑：150 mmol/L NaCl，400目活性炭粉(天津致遠化工試劑有限公司)，引物合成于上海生物工程技術有限公司，SYBR Green I(invitrogen)，裂解液(Extract-N-Amp? Plant PCR Kit,Sigma-Aldrich)，PCR試劑(北京全式金生物技術有限公司)。

2 實驗方法

2.1 驗證活性炭吸附DNA

用半夏在商業的裂解液(Sigma)中進行裂解，離心取上清，將其平均分為三份，NC不做任何處理，1號在95 ℃金屬浴中加熱20 min，2號加入100 mg活性炭，并在95 ℃金屬浴中加熱20 min，12 000 rpm離心3 min。取NC、1、2號上清液作為模板進行PCR。擴增引物為半夏的特異性引物BP：5′-GGGAGACTCCCG ACGATCGCA-3′，BRP:5′-GCCGCACG GACGGATGGAT-3′[4]，反應25 μL體系，包括2.5 μL 10×Taq buffer，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L BP，0.5 μmol/L BRP，2.5 U Taq DNA聚合酶，1 μL 模板，其余用水補齊。擴增條件94 ℃預變性3 min，94 ℃變性溫度30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環，最后72 ℃延伸5 min。

2.2 促進中藥材的裂解

將中藥材研磨成細粉，稱取10～20 mg粉末至1.5 mL EP管中，陰性對照組加入600 μL 150 mmol/L NaCl作為裂解體系，并加入8 μL的滅菌水，實驗組將滅菌水替換為8 μL 100 mg/mL(裂解體系活性炭終濃度為1.33 mg/mL)活性炭(AC)，兩組均在漩渦震蕩儀上震蕩均勻，并將其置于恒溫儀上95 ℃震蕩處理10 min。取混懸裂解液作為PCR模板。用商業化的裂解液裂解相應的中藥材作為陽性對照。擴增中藥材用ITS2通用引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′，ITS3R:5′-GACGCTT CTCCAGACTACAAT-3′[3]，反應25 μL體系，加2.5 μL 10×Taq buffer，0.2 mmol/L dNTP，0.5 μmol/L ITS2F，0.5 μmol/L ITS3R，2.5 U Taq DNA聚合酶，1 μL 模板，其余用水補齊。在RT-PCR反應中，25 μL體系加入終濃度0.4×的SYBR Green I，其他試劑用量與普通PCR一致，加水至25 μL。PCR擴增條件：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性溫度30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，除槐米擴增22個循環，其余均擴增30個循環，最后72 ℃延伸5 min。普通PCR產物在3%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，RT-PCR經過實時熒光定量曲線，自動設置熒光閾值，得到熒光值對應的Ct值，從而計算出加入AC前后的δCt值。

2.3 顯微觀察活性炭對細胞裂解的作用

同2.2的裂解處理后，取藏紅花裂解后的混懸液于載玻片上，蓋上蓋玻片，在顯微鏡下放大160倍觀察。

3 實驗結果

3.1 驗證活性炭吸附DNA

由于AC有較強的吸附作用，所以我們猜想AC在細胞裂解的過程中是否有增加模板量的作用。因此，我們驗證了AC是否能吸附DNA。驗證材料為半夏裂解液，其特異性引物擴增的條帶長度為114bp，如圖1所示，擴增條帶為目標條帶，NC和1號的條帶亮度差異不大，所以排除了95 ℃高溫對DNA有降解的作用。2號加了AC吸附半夏基因組DNA，對比NC，DNA模板幾乎完全被AC吸附了，說明AC有很強的吸附DNA的作用。在裂解液裂解細胞釋放DNA的過程中，有部分細胞的結構不會完全被破壞，胞內的DNA就會纏繞在細胞膜表面或者是被阻滯在細胞結構內，導致這部分DNA不能作為PCR模板而用于檢測，由于上述結果顯示AC有很強的吸附DNA的作用，所以我們推測，在裂解過程中加入AC可以將原本不能釋放出來的那部分DNA吸附在其表面，從而能起到增加模板量的作用。

圖1 驗證AC吸附DNAFig.1 Verifying absorption ability of DNA by AC注：M--DNA marker；以下為PCR產物：NTC--無模板PCR陰性對照；NC--未經任何處理的半夏裂解液；1--半夏裂解液在95 ℃下處理20 min；2--半夏裂解液中加入AC 150 mg，95 ℃處理20 min。Note:M--DNA marker;The following is PCR products:NTC--No template negative control;NC--Without any treatment of Pinellia lysate;1--Pinellia lysate was treated at 95 ℃ for 20 min;2--Adding AC 150 mg in Pinellia lysate,95 ℃ for 20 min.

3.2 促進中藥材的裂解

為了進一步證明我們的猜想，我們選用槐米、藏紅花和三七花等常用且價格較高的藥材作為驗證材料，這些藥材在市面上容易被摻假。根據圖2顯示，由于四種中藥材均用ITS通用引物ITS2F和ITS3R擴增，植物的條帶長度相近，在瓊脂糖膠上幾乎看不出差異，我們用商業裂解液裂解樣品的擴增產物作為陽性對照。同種材料在相同的擴增條件及循環數下，2，5，8，11(在NaCl溶液中加入AC進行裂解)的條帶均比對應的1，4，7，10(僅在NaCl溶液中進行裂解)要深。特別是藏紅花的條帶差異極為顯著，10號未擴增出條帶，11號條帶明顯，說明在NaCl中加了AC的裂解效果比只在NaCl中要好。這個結果說明AC確實有增加模板量的作用，我們猜測AC可能將未被釋放到NaCl中的DNA吸附在其表面，這部分DNA加入擴增體系中可以進行PCR，從而增加模板量。另外也有可能是AC促進了細胞的破裂，使得DNA釋放更充分。

圖2 AC促進中藥材的裂解Fig.2 AC improved the lysis of traditional herbal medicine注：M--DNA Marker；NTC--PCR陰性對照；1、2、3--槐米；4、5、6--三七花；7、8、9--甘草；10、11、12--藏紅花；1、4、7、10僅用NaCl溶液裂解，2、5、8、11用NaCl溶液加AC裂解；3、6、9、12--用商業裂解液裂解(作為陽性對照)。Note:M--DNA Marker;NC--Negative control;1,2,3--sophora flower;4,5,6--Netoginseng flower;7,8,9--Glycyrrhiza;10,11,12--Saffron;1,4,7,10--only lysated with NaCl solution,5-8 Adding AC in the NaCl solution to lysate;3,6,9,12--lysising with commercial Lysate (as positive control).

為了對增加的模板進行定量，我們運用了實時熒光定量PCR儀對在裂解液中加AC與未加的樣品的模板量進行了比較。如圖3所示，列舉了四種常見中藥材的實時熒光定量PCR曲線圖，在裂解液中加入AC后，Ct值均有顯著變化。δCt值的差異反映了PCR的模板量差異，Ct值越大，模板量就越少，相反則模板量越多。Ct值減少1，則表示模板量增加2倍，如圖3中槐花、三七花、半夏和藏紅花的δCt值分別為2.47、3.91、2.75、4.92，模板量分別增加了5.54、15.03、6.73、30.27倍。其中，藏紅花加入AC裂解后模板量增加了30.27倍，這充分證明了AC在裂解過程中促進裂解增加模板量的作用。

3.3 顯微觀察活性炭對細胞裂解的作用

為了進一步探究AC增加模板量的原因，我們對加入AC與否的裂解液進行了顯微觀察比較。如圖4所示，A圖是僅在150 mmol/L NaCl中裂解藏紅花，B圖是在150 mmol/L NaCl中加入AC一起裂解。將裂解完成后的藏紅花裂解液置于顯微鏡下觀察，我們發現A圖中，藏紅花細胞多聚集、呈完整狀態或碎片較大，而在B圖中，細胞分散、結構明顯多被破壞，碎片相對較小。這個結果沒能直接證明我們之前的猜測，但是根據顯微觀察的結果顯示，我們驚奇地發現AC的在細胞的裂解過程中可能有撞擊、割裂或者摩擦細胞的機械作用，使得細胞中的DNA能夠更好地釋放出來，從而增加了被裂解樣品的模板量。AC是否會吸附未被充分釋放在裂解液中的DNA模板用于下游分析，還有待驗證。

4 討論

近年來，有很多固相提取DNA的材料相繼問世，例如用多聚賴氨酸包裹的硅顆粒來提取尿液中的DNA[4]；多聚離子流體涂層提取復雜樣本中的DNA[5]；用多層硅熱塑性薄片提取高分子量DNA[6]；用庚二亞氨酸二甲酯(DMP)與胺基協同吸附血液及細菌中的DNA和RNA[7]；用殼聚糖修飾的fusion 5濾紙[8]和磁珠[9]吸附樣本DNA，可以直接用于下游PCR分析；但是這些材料在制作方面相對復雜，真正產業化可能還需要一些時間，所以找一種已經產業化的材料來提取DNA，老材料新用法可以縮短從試驗到應用的時間。經過一番了解與試驗，我們探索出了一種利用活性炭提取DNA的方法。活性炭是一種不規則的多孔炭材料，具有較大的比表面積，對氣體、色素以及揮發性有機物具有很強的吸附作用，多用于凈化空氣、水質以及脫色等[10]。活性炭表面有豐富的含氧官能團和含氮官能團，這也就使活性炭有了特殊的化學性能，能通過離子交換作用、靜電作用、擴散力、供-受電子交換作用對其他物質進行吸附[11]。在本文中，我們用活性炭來吸附提取DNA，將活性炭的用途擴大到了分子生物學的領域。

圖3 用實時熒光PCR驗證AC促進中藥材的裂解Fig.3 Verifying activated carbon improved the lysis of Chinese herbal medicine with real-time PCR.注：A.槐米；B.三七花；C.甘草；D.藏紅花；NTC--PCR陰性對照；NC--僅以NaCl為裂解液；AC--在NaCl中加入終濃度為1.33 mg/mL的AC；CtNC、CtAC為NC和AC的Ct值，δCt值為CtNC和CtAC之差。Note:A.sophora flower;B.Netoginseng flower;C.liquorice;D.saffron;NTC--No template control;NC--only lysated with NaCl solution；AC--Adding final concentration of AC is 1.33 mg/mL;CtNC,CtAC is the Ct value of NC and AC,and the δCt is the difference between CtNC and CtAC.

圖4 顯微觀察AC對細胞裂解的作用Fig.4 Microscopic observation of the effect of activated carbon on cell lysis.注：A.藏紅花在150 mmol/L NaCl中裂解。B.藏紅花在含終濃度1.33 mg/mL的AC的150 mmol/L NaCl中裂解Note:A.The saffron was lysated in 150 mmol/L NaCl solution.B.The saffron was lysated in 150 mmol/L NaCl solution with AC of final concentration is 1.33 mg/mL.

我們開發的這種DNA提取方法采用NaCl溶液作為裂解液，簡單易得且經濟實惠。在其中加入一定量的AC，AC本身不會影響PCR，所以可以直接取包含AC的混懸裂解液作為模板用于PCR等下游分析檢測。在探究AC增加模板量的原因時，我們通過顯微觀察結果證明，AC確實能夠通過機械作用在裂解過程中破壞細胞，釋放出更多的DNA。但是AC是否可以將未被完全釋放的DNA吸附在其表面，還需要在以后實驗中進一步驗證。

目前商業的試劑盒價格都在幾百上千不等，并且操作繁瑣，需要多次離心、洗脫等步驟，裂解時間也較長，對于大樣本量的DNA提取是耗時且極為不方便的。而我們開發的這種簡易提取DNA的方法輕松地解決了這個問題，僅需要NaCl溶液和AC粉末，即可快速提取DNA。這種簡單快速的DNA提取方法可以應用到中藥材的DNA提取中，適合大量樣本的DNA提取，為實際操作帶來了極大的便利。同時，AC對DNA吸附與解吸也是一個重要的研究方向，基于AC極強的吸附能力，如果能夠找到AC的解吸劑，那么就可以開發出一種提取DNA及分離純化DNA的新方法，這在DNA提取領域將是一個新的突破。