煙葉中一個新的氨基糖苷化合物

楊彩艷,元輝雄,潘喬丹,黃元河,楊文沛,黃祖良

1右江民族醫(yī)學院藥學院，百色，533000；2廣西高校右江流域地道中藥材 (民族醫(yī)藥) 研究重點實驗室，百色 533000；3 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，百色，533000

茄科煙草屬植物包含普通煙草、黃花煙草和碧冬煙草三個亞屬共約67個品種，其中除普通煙草(NicotianatabacumL.)和黃花煙草(NicotianarusticaL.)可以直接栽培利用外其它均為野生種；野生煙形態(tài)各異、用途不一、無直接商業(yè)價值，但它們具備較為突出的抗病、抗蟲、抗逆性基因，這些基因轉(zhuǎn)移到栽培品種得到如Kentucky 56、Burley 21、K358等多種抗病毒、抗蟲害煙草種；因此作為重要經(jīng)濟作物的煙草(N.tabacum)因其不同品種在育種過程中采用雜交、轉(zhuǎn)移野生煙的品種和基因不同導致其香味、化學成分、活性差別較大[1-3]。前人對煙葉非揮發(fā)性化學成分研究發(fā)現(xiàn)包括黃酮、生物堿、萜類、香豆素、酚類化合物等大約兩百個化合物，我們之前從云南采集的煙葉中分離到6個降倍半萜、2個倍半萜和1個生物堿共9個新化合物[4-10]。前人關(guān)于煙草及其化合物藥理活性研究表明其具有如抗AD (阿爾茨海默病)、抗癌、抗菌、降血糖和抗炎等多種生物活性[5,9,11-13]。為研究環(huán)境、氣候、地理位置等對植物化學成分及生物活性影響，為擴大煙草的利用價值提供科學理論和實驗依據(jù)，我們對世界長壽之鄉(xiāng)廣西樂業(yè)縣煙葉的化學成分及生物活性進行系統(tǒng)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)一個新的、天然產(chǎn)物中結(jié)構(gòu)不常見的化合物煙草羥基氨基糖苷(1)。通過廣泛的核磁波譜數(shù)據(jù)分析確定化合物1的結(jié)構(gòu)為3-O-二十六?；?1-O-(6-去氧-6-羥基氨基-α-D-葡萄糖基)-甘油[3-O-heptacosanoyl-1-O-(6-deoxy-6- hydroxyamino-α-D-glucosyl)-glycerol]。在化合物1對胃癌MGC-803細胞的生物活性實驗中，1沒有表現(xiàn)明顯的生物活性。

1 實驗

1.1 儀器和材料

旋光使用Jascomodel 1020 polarimeter 旋光儀(Horiba,Tokyo,Japan)測定。高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)采用LCMS-IT-TOF質(zhì)譜儀(Shimadzu,Kyoto,Japan)測定；紅外光譜(IR) 經(jīng)KBr壓片后用Bio-Rad FTS-135型紅外光譜儀(Bio-Rad,Hercules,California,USA)測定；核磁共振譜采用Brucker DRX-500和Bruker Avance III-600型超導核磁共振儀(Bruker,Bremerhaven,Germany)測定。柱色譜的材料為硅膠(200～300 目,青島美高集團有限公司,青島,中國)、C18(Merck,Darmstadt,Germany)、Sephadex LH-20(Amersham Bioscience,Sweden)和MCI CHP 20P(Mitsubishi Chemical Institute,Tokyo,Japan).HP90 CO2培養(yǎng)箱(上海力申科學儀器有限公司,上海,中國)、DMIL LED 倒置式生物顯微鏡(Leica,Solms,Germany)和MK3 酶標儀(上海塞默飛世爾儀器有限公司,上海,中國)用于活性測試。

煙葉采自廣西壯族自治區(qū)樂業(yè)縣，由右江民族醫(yī)學院的黃元河副教授鑒定為N.tabacumLinn。標本(No.2015-06-06)存放于右江民族醫(yī)學院藥學院楊彩艷老師研究組。

1.2 提取和分離

干煙葉(2.6 kg)依次使用EtOH-H2O(90∶10,50∶50,v/v)浸提3次，每次3天，最后用沸水提取0.5 h，提取液混合濃縮后進一步使用 H2O和EtOAc萃取。把EtOAc 層萃取液回收后獲得EtOAc部分浸膏(498 g)。EtOAc部分浸膏經(jīng)過硅膠柱色譜(3.0 kg,20.0×100 cm) 使用CHCl3-MeOH-H2O(100∶0∶0,95∶5∶0,90∶10∶0,80∶20∶2)作為流動相分離得到 Frs.1-8.Fr.7 (38 g)使用 MCI CHP 20P 柱層析(310 g,4.0×40 cm)以 MeOH-H2O(20∶80,40∶60,60∶40,80∶20,100∶0)洗脫產(chǎn)生Frs.7.1-7.5。Fr.7.2(12.9 g)通過硅膠柱色譜(300 g,6.0×50 cm)以 EtOAc-MeOH-H2O(80∶20∶2)為流動相分離提供Frs.7.2.1～7.2.4。Fr.7.2.4(5.5 g)經(jīng)過硅膠柱色譜CC(160 g,5.0×50 cm)以EtOAc-MeOH-HCOOH-H2O(85∶15∶1.5∶1.5)為流動相洗脫獲得 Frs.7.2.4.1-7.2.4.6。Fr.7.2.4.5(0.94 g)先使用硅膠柱層析 CC(30 g,1.8×50 cm)以 CHCl3-MeOH-HCOOH(80∶20∶2)為流動相分離，進一步使用Sephadex LH 20(50 g,1.4×150 cm)純化獲得化合物1(5 mg)。

1.3 活性測試

化合物1在胃癌MGC-803細胞上的活性測試參考我們之前報道的方法進行[14]。 把細胞接種于96-孔培養(yǎng)板并保持5000 個細胞/mL的密度于37 ℃和5 % CO2條件下培養(yǎng)1天。在測試組和空白組中都以新鮮溶液代替培養(yǎng)液在37 ℃、飽和濕度和 5% CO2條件下培養(yǎng)2天。然后在孔中加入20 μL MTT 試劑(5 mg/mL)并在 37 ℃ 下培養(yǎng) 4 h。最后使用酶標儀讀出各孔的光密度值。

2 結(jié)果和討論

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定

煙草氨基糖苷(1)，(+) HR-ESI-MSm/z648.4097 [M+H]+表明其分子式為C35H69O9N，不飽和度為2。IR表明其含有羥基和羰基(3417,1737 cm-1)；1H 和13C NMR 數(shù)據(jù)(表 1) 表明其含有一個正構(gòu)長鏈酰基[δH2.32 (m),1.62 (m),1.34 (m),1.28 (m),1.26 (m) 和 0.88 (t,J= 7.0 Hz);δC175.1,35.1,33.1,30.1-31.2,26.0,23.8 和 14.6]、糖基 [δH4.74 (d,J= 3.6 Hz),3.35 (dd,J= 14.0,2.3 Hz),2.90 (dd,J= 14.0,9.3 Hz);δC100.0,73.4,75.1,75.2,70.2和54.5] 和一個甘油基[δH4.07 (dd,J= 10.7,5.3 Hz),3.54 (dd,J= 10.7,6.3 Hz),5.28 (m),4.48 (dd,J= 12.2,2.7 Hz) 和 4.20 (dd,J= 12.2,6.8 Hz);δC67.1,71.6 and 64.0]。此外，糖基的1H和13C NMR數(shù)據(jù)與methyl 6-deoxy-6-hydroxyamino-α-D-glucupyranoside 非常相似推測糖基為6-去氧-6-羥基氨基-α-D-葡萄糖基(6-deoxy-6-hydroxyamino-α-D-glucosyl)[15]。糖基中H-1′ 和H-2′之間較小的1H-1H耦合常數(shù)(3.6 Hz)，13C NMR中C-6′化學位移從α-D-葡萄糖基中60.9 向高場移動到化合物1中 54.5，以及ROESY中H-1′ (δH4.74)/ H-2′ (3.40)/H-4′ (3.08)/H-6′a(2.90)和 H-3′(3.60)/H-5′(4.01)關(guān)鍵的相關(guān)關(guān)系(見圖2)證實了以上的推測[16]。HMBC中H-1 (4.07)/C-1′ (100.0),H-3 (4.20)/C-1″ (175.1)相關(guān)關(guān)系(見圖2)表明糖基和?；謩e連接在甘油基團的C-1和C-3上。最后根據(jù)分子式可推測正構(gòu)長鏈?；鶠槎；?。至此化合物1的結(jié)構(gòu)鑒定為3-O-二十六?；?1-O-(6-去氧-6-羥基氨基-α-D-葡萄糖基)-甘油(3-O-heptacosanoyl -1-O-(6-deoxy-6-hydroxyamino-α-D-glucosyl)-glycerol)，為一新化合物，命名為煙草羥基氨基糖苷。

表1 化合物1在甲醇中的1H 和 13C NMR數(shù)據(jù) (δ 為ppm,J 為 Hz)

圖1 化合物1的結(jié)構(gòu)Fig.1 The structure of compound 1

圖2 化合物1關(guān)鍵的1H-1H COSY、HMBC和ROESY關(guān)系Fig.2 The key 1H-1H COSY,HMBC and ROESY correlations of compound 1

化合物1白色粉末。[α]24 D:- 8.5 (c 0.08,MeOH);IR (KBr)vmax3417,1737,1626,1464,1384,1149,1118 cm-1;1H (500 MHz) 和13C (125 MHz) NMR 數(shù)據(jù)見表 1;HR-ESI-MSm/z648.4097 (計算值為 C35H69O9N,648.5045)。

2.2 活性測試結(jié)果

化合物1在胃癌MGC-803 細胞系上體外抗癌活性通過MTT法進行評價，但在濃度為50 μg/mL時其對MGC-803 細胞的抑制率為18%，沒有表現(xiàn)比較明顯抗胃癌細胞增值活性。

3 結(jié)論

據(jù)我們所知，煙草羥基氨基糖苷是首次從天然資源中分離的一個新的、不常見的天然產(chǎn)物，它豐富了天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和類型，這將為進一步研究天然資源尤其是煙草植物化學成分提供有價值的信息；此外，氨基糖苷類是古老的抗微生物藥物之一，具有抗革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、分枝桿菌及抗原蟲等抗菌活性，是治療革蘭陰性菌和結(jié)核桿菌感染的首選藥物之一[17,18]。因此，今后進一步分離純化煙草化學成分或?qū)煵萘u基氨基糖類化合物進行合成或半合成可以為研究此類化合物生物活性研究提供物質(zhì)基礎，也可以解決本論文中尚未解決的C-2原子絕對構(gòu)型問題。