基于高效液相指紋圖譜和化學計量法的防風藥材及其偽品的鑒別

張 丹，木盼盼，郭 梅，鄭開顏，李國川，侯芳潔，郭 龍*，鄭玉光*

1河北中醫學院藥學院；2河北中醫學院實驗中心，石家莊 050200

防風為傘形科植物防風Saposhnikoviadivaricata(Turcz.)Schischk.的干燥根，具有祛風解表，勝濕止痛，止痙的功效，主要用于感冒頭痛，風濕痹痛，風疹瘙癢，破傷風等癥[1]。近年來防風需求量日益增大，而野生藥材資源日益減少，難以滿足市場需要，栽培防風逐漸成為市場的主流。目前，防風藥材品質差異較大，主要體現在規范化種植防風所占面積較小以及地方習用品的混入，造成主流市場真偽混雜、質量良莠不齊。現代研究表明，防風含有色原酮類、香豆素類、有機酸、多糖類、聚炔類、甾醇類等多種化學成分，具有解熱、鎮痛、抗炎、抗菌、抗腫瘤、抗驚厥等作用[2,3]。其中所含的色原酮類成分，是其發揮解熱、鎮痛、鎮靜、抗炎、抗氧化作用的主要活性成分[4-8]。可見，對于防風藥材進行質量評價可從其所含色原酮類成分著手，測定色原酮類成分含量，以初步對防風藥材的質量及真偽進行評價。因此，本實驗以其中色原酮類成為作為質量評價的指標，借助高效液相色譜法對防風藥材及其偽品進行區分，以期完善防風的質量評價體系，并建立基于HPLC法的防風藥材的真偽鑒別手段。

1 材料

1.1 試驗設備

島津LC-20 A高效液相色譜儀(日本島津制作所)；Shimadzu inertsil ODS-2高效液相色譜柱 C18(5 μm,4.6 × 250 mm)；BSA224S-CW電子分析天平(賽多利斯科學儀器有限公司)；HH-2數顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)；KQ2200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試驗試劑

乙腈(色譜純，Fisher Scientific Co.Ltd.)，甲醇(色譜純，Fisher Scientific Co.Ltd.)，水為超純水，其余試劑均為分析純；升麻素苷(批號PRF7040523，純度 > 98% )，升麻素(批號PRF7090123，純度>98%)，5-O-甲基維斯阿米醇苷(批號PRF7083021，純度>98%)，亥茅酚苷(批號PRF7083022，純度>98%)均購自于成都普瑞法科技開發有限公司。

1.3 實驗藥材

27批藥材購買于各地藥材市場，經河北中醫學院生藥學教研室鄭玉光教授鑒定為防風S.adivaricata(Turcz.)Schischk.(關防風、口防風)、葛縷子CarumcarviL.(小防風)、竹葉西風芹SeselimaireiWolff.(云防風)、寬萼巖風Libanotislaticalycina(水防風)的干燥根，憑證標本保存于河北中醫學院生藥學研究室。具體見表1。

表1 防風樣品詳細信息

續表1(Continued Tab.1)

編號No.產地Growing area品種Cultivated varietiesS22甘肅岷縣Min Country,Gansu小防風XiaofangfengS23甘肅定西Dingxi,Gansu小防風XiaofangfengS24甘肅甘南Gannan,Gansu小防風XiaofangfengS25云南大理Dali,Yunnan云防風YunfangfengS26云南大理Dali,Yunnan云防風YunfangfengS27云南楚雄Chuxiong,Yunnan云防風Yunfangfeng

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Inertsil ODS-2 C18(5 μm,4.6 × 250 mm)；流動相乙腈 (A)-水溶液 (B)梯度洗脫，洗脫程序為(0～20 min，15%～25% A，20～30 min，25%～50% A，30～40 min，50%～50% A)，流速1 mL/min；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；按升麻素苷計算理論塔板數應不低于2 000。對照品及樣品(S1)圖譜見圖1。

圖1 防風藥材(S1)的HPLC圖譜Fig.1 HPLC Chromatogram of Saposhnikoviae Radix注：A.對照品；B.樣品(S1)；1.升麻素苷；2.升麻素；3.5-O-甲基維斯阿米醇苷；4.亥茅酚苷。Note:A.Reference substance;B.Sample (S1)；1.Prim-O-glucosylcimifugin；2.Cimifugin；3.4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol；4.Sec-O-glucosylhamaudol.

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取對照品適量，用甲醇溶解配制升麻素苷、升麻素、5-O-甲基維斯阿米醇苷、亥茅酚苷的對照品混合溶液，濃度分別為0.080、0.018 4、0.081 6、0.040 8 mg/mL。

2.3 供試品溶液的制備

防風藥材粉碎過40目篩，干燥至恒重，精密稱取樣品粉末約l g(詳見表3)，放在具塞錐形瓶中，精密加入甲醇40 mL，稱重，水浴回流提取2 h，放冷，用甲醇補足失重，搖勻，以0.22 μm濾膜過濾。取續濾液，即得。

3 結果

3.1 防風藥材4種成分含量測定

3.1.1 線性關系考察

將混合對照品溶液用甲醇稀釋成一系列梯度濃度的溶液，按照2.1項下色譜條件進樣分析。以對照品的峰面積為縱坐標，以樣品濃度為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程和線性范圍，結果見表2，各成分在各自濃度范圍內線性關系良好。

3.1.2 精密度試驗

將混合對照品溶液，按照“2.1項”下色譜條件重復進樣6次，計算4種成分的RSD(n=6)，考察精密度。5-O-甲基維斯阿米醇苷、升麻素苷、升麻素、亥茅酚苷的RSD分別為0.97%、0.59%、1.14%、1.64%，表明儀器精密度良好。

表2 防風4種成分的標準曲線、線性范圍

3.1.3 穩定性試驗

精密吸取同一防風(S4)供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0、2、4、8、12、24、48 h進樣，以3號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD<3.0%，相對峰面積的RSD<3.0%，表明防風供試品溶液在制備后48 h內穩定。

3.1.4 重復性試驗

取同一批防風(S4)粉末約1 g，平行6份(取樣量分別為1.001 5、1.001 1、1.001 2、1.001 1、0.999 8、1.000 9 g)，精密稱定，按2.3項下方法處理，得供試品溶液，按照“2.1項”下色譜條件分別進樣，以3號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD都小于3.0%，相對峰面積的RSD都小于3.0%，表明該方法的重復性良好。

3.1.5 加樣回收率試驗

取已知含量(S4)的防風藥材樣品約0.5 g，平行6份，精密稱定(取樣量分別為0.500 5 、0.501 1、0.499 8、0.501 2 、0.500 1、0.500 9 g)，分別加入4種對照品適量，按2.3項下方法制備供試品溶液，2.1項下色譜條件進行進樣分析，計算4種成分的加樣回收率。升麻素苷，升麻素，5-O-甲基維斯阿米醇苷，亥茅酚苷的平均回收率分別為99.8%、97.9%、102.4%、101.5%；RSD值分別為2.3%、1.9%、1.2%、1.5%。

3.1.6 樣品的含量測定

按照2.3項下方法制備27批供試品溶液，按2.1項下色譜條件分別測定27批樣品中升麻素苷，升麻素，5-O-甲基維斯阿米醇苷，亥茅酚苷的含量，結果見表3。

表3 27批防風樣品中4種成分的含量

續表3(Continued Tab.3)

編號No.取樣量Weight(g)升麻素苷Prim-O-glucosylcimifugin(%)升麻素Cimifugin(%)5-O-甲基維斯阿米醇苷4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol(%)亥茅酚苷Sec-O-glucosylhamaudol(%)升麻素苷+5-O-甲基維斯阿米醇苷Prim-O-glucosylcimifugin+4′-O-β-Glucopyranosyl-5-O-methylvisamminol(%)S191.00120.0214----S201.0009-----S210.99790.0479----S220.9995-----S231.0015-----S241.00430.01620.0040---S251.00050.05800.0085---S261.00020.08250.0107---S271.0019-0.0041---

注：-表示未檢測到。

Note:-Indicated no detection.

由含量測定結果可知，小防風和云防風均無法檢測到《中國藥典》2015版規定的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷；但河南水防風的含量測定的指標滿足藥典的規定，即升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的總量不得少于0.24%[1]，通過對4個成分的定量還發現，水防風中升麻素的含量要高于正品防風，亥茅酚苷的含量則低于正品防風，具體的規律需要進一步的實驗證明。因此，通過HPLC法可將小防風和云防風鑒別為偽品，但水防風滿足藥典標準，在實際應用中要注意鑒別。可見通過HPLC的含量測定方法在防風鑒別上具有一定的局限性。

3.2 防風的指紋圖譜研究

鑒于HPLC法在防風真偽鑒別上的局限性，為了更加突出不同來源防風的差異，本實驗繼續借助HPLC指紋圖譜的方法區分真偽防風，以期更加全面評價不同來源的防風藥材及其偽品。

3.2.1 精密度試驗

精密吸取同一防風樣品(S4)供試品溶液，連續同一條件進樣6次，以1號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD<3.0%，相對峰面積的RSD<3.0%。

3.2.2 穩定性試驗

精密吸取同一防風(S4)供試品溶液，分別在供試品溶液制備后第0、2、6、8、12、24、48 h進樣，以1號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD<3.0%，相對峰面積的RSD<3.0%，實驗結果證明供試品溶液在制備后48 h內穩定。

3.2.3 重復性試驗

取同一批防風( S4)粉末約1 g，平行6份，精密稱定，按2.3項下方法處理，得供試品溶液，分別進樣，記錄特征圖譜，以1號峰為參照峰，各特征峰保留時間的RSD<3.0%，相對峰面積的RSD<3.0%，表明該方法的重復性良好。

圖2 27批防風藥材HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints of 27 batches about Saposhnikoviae Radix

3.2.4 指紋圖譜相似度分析

27批防風樣品的色譜圖見圖2，采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統2004版”對所得色譜圖進行數據處理，以S1作為參比圖譜，采用中位數法，在時間窗寬度為0.10時，確定共有峰9個，生成對照指紋圖譜見圖3。6個不同品種的防風藥材指紋圖譜與對照圖譜比對，各樣品之間的相似度為0.087～0.997之間，相似度結果見表4。由結果可知防風與其偽品之間的相似度較差，突出表現為小防風、云防風、水防風與正品防風的區別性；而正品防風之間則具有較好的相似度。因此，所建立的防風藥材的指紋圖譜可用于防風藥材的鑒別。

3.3 結合化學計量法的防風藥材的真偽鑒別

為了驗證已建立的防風的質量評價方法，同時進一步說明不同等級的防風藥材的內在品質差異，本研究運用系統聚類分析和主成分分析法對數據進行分析，確保結果可靠準確。

圖3 防風藥材的對照指紋圖譜Fig.3 Reference fingerprint of Saposhnikoviae Radix

No.相似度SimilarityNo.相似度SimilarityNo.相似度SimilarityS10.983S100.870S190.286S20.986S110.997S200.087S30.982S120.976S210.144S40.930S130.974S220.233S50.993S140.982S230.151S60.982S150.884S240.400S70.988S160.948S250.703S80.980S170.854S260.810S90.893S180.786S270.266

3.3.1 系統聚類分析

利用系統聚類分析可將具有相似性的樣品歸為一類的特點。用SPSS 22.0軟件對本實驗27批樣品進行聚類分析，將4個色原酮成分的百分含量作為原變量，所有數據經過標準化處理，聚類方法采用組間連接法及平方歐式距離法，結果見圖4。由圖4

圖4 防風藥材聚類分析樹狀圖Fig.4 Hierarchical cluster analysis of Saposhnikoviae Radix

可知，防風藥材及其偽品可被分為2類，即關防風和口防風一類，栽培防風和偽品一類。

3.3.2 主成分分析

在聚類分析的基礎上，采用SIMCA 13.0軟件對原變量進行主成分分析。由主成分分析結果可知，前兩個主成分累積貢獻率為94.14%，其中第一主成分貢獻率為74.14%，第二主成分貢獻率為19.99%，相關結果如圖所示(見圖5)。主成分分析結果與聚類分析結果基本一致，即可將防風藥材基本分為正品防風和偽品防風，可見對防風中4個成分的定量分析，可將防風藥材及其偽品區別開來，所建立的分析防風可用于防風藥材的真偽鑒別。

圖5 防風藥材主成分分析圖Fig.5 PCA of Saposhnikoviae Radix

成份Composition初始特征值Initial eigenvalue提取平方和載入Extract square sum loading合計Total方差貢獻率Variance contribution rate(%)累積方差貢獻率Cumulative variance contribution rate(%)合計Total方差貢獻率Variance contribution rate(%)累積方差貢獻率Cumulative variance contribution rate(%)12.56674.14474.1442.56674.14474.14421.20019.99394.1371.20019.99394.13730.1463.63897.77540.0892.225100.000

根據聚類分析和主成分分析結果，結合含量測定的結果可將正品防風和偽品防風進行分類，所建立的定量分析方法可用于正品防風藥材的區分鑒別與質量控制。

4 討論

防風中含有色原酮類、香豆素類、揮發油類和多糖類等多種成分類型，以色原酮類為其主要活性成分[2]。本研究采用高效液相色譜法測定了其中的4個色原酮類成分并建立了高效液相指紋圖譜，結果表明正品防風各批次之間的相似度均大于0.870，與偽品的相似度比較P<0.01，說明正品防風與偽品防風之間具有極顯著性差異，所建立的含量測定方法可用于防風藥材的真偽鑒別。

為了進一步對防風藥材及其偽品進行區分，借助系統聚類分析和主成分分析對含量測定的結果進行分析。結果說明，基于含量測定的結果可以將防風藥材及其偽品區分開來。所建立的基于含量測定和化學計量學結合的方法可用于防風藥材及其偽品的鑒別。

以《中國藥典》2015版的標準，河南產水防風的含量符合藥典要求[1]，而本實驗通過測定其中的4個色原酮類成分并建立化學指紋圖譜的方法可以將其區分開，說明藥典的含量測定指標在鑒定防風藥材的真偽上具有一定的局限性。因此，本實驗所建立的方法既能比較全面、綜合地比較防風譜圖之間的相似關系，又能比較不同產地的防風譜圖之間的差異，為防風藥材的真偽鑒別提供較好的依據。