酸酯堿成分結合指紋圖譜優選鹽黃柏炮制工藝

程中琴，劉小妹，施崇精，王姍姍，盛 蓉，袁強華，宋 英

1成都中醫藥大學藥學院，成都 610075;2成都中醫藥大學附屬醫院，成都 610072

黃柏來源于蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid.的干燥樹皮。習稱“川黃柏”[1]。始載于《神農本草經》，列為上品。[2]該藥味苦、性寒，歸腎、膀胱經。具有清熱燥濕，瀉火除蒸，解毒療瘡之效。用于濕熱瀉痢、黃疸、帶下、熱淋、腳氣、骨蒸勞熱、盜汗、遺精、瘡瘍腫毒、濕疹瘙癢等病的治療，為臨床常用藥[3]。傳統理論認為生黃柏性味苦寒，清熱燥濕、瀉火解毒作用強，但苦寒過甚，應用不當易傷脾胃；鹽炙后可緩和苦寒之性，不易傷脾胃，并借鹽引藥入腎之功而增強滋陰瀉相火之力[4]。根據2015年版《中國藥典》的附錄ⅡD鹽水炙法中對鹽制黃柏規定：“取凈藥材，加鹽水拌勻，悶透，置鍋內，以文火加熱，炒至規定的程度時，取出，放涼。每100 kg凈藥材用食鹽2 kg。”[1]但對黃柏的鹽制工藝如炮制溫度和時間、炒藥量并未做明確規定。本文以指紋圖譜全面反映藥材的化學成分，以鹽黃柏中三大類主要成分(生物堿和酸類、酯類)為指標，定性定量的分析不同炮制工藝，以期為進一步規范黃柏鹽炙工藝，確保良好的臨床效果。通過探討影響黃柏鹽炙工藝的幾個因素，為制定黃柏鹽制的合理炮制工藝標準提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

1260-Ⅱ型HPLC儀，包括四元泵、DAD檢測器、在線脫氣裝置、Openl AB工作站(Agilent公司，美國)；BP211D型十萬分之一電子分析天平(Mettler-Toledo公司，瑞士)；AS20500BD 型超聲清潔儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)；CXP-500A 型高速多功能粉碎機(上海市晟喜制藥機械有限公司)；MS-5型炒貨機(邁斯機械)。

1.2 試藥

對照品鹽酸小檗堿(批號:15401-69-1，純度98.0%)，鹽酸小檗紅堿(批號633-65-8，純度為 98%)，巴馬汀(批號10605-02-4，純度98.0%)，木蘭花堿(批號:2141-9-5，純度98.0%)，黃柏內酯(批號：1180-71-78，純度99.03%)，異綠原酸B(批號：1453461-3，純度98.97%)，3.5-O-二咖啡酰奎寧酸(批號：89919-62-0，純度99.25%)，均購自成都植標化純生物技術有限公司；鹽酸黃柏堿(批號:111895-201504，純度94.9%)，鹽酸藥根堿(批號:110733-201609，純度89.5%)，均購自中國食品藥品檢定研究院。生黃柏(批號：170721)，由四川省中藥飲片有限責任公司提供，經成都中醫藥大學附屬醫院盛蓉主任藥師鑒定為蕓香科植物黃皮樹的干燥樹皮。乙腈、甲醇(天地公司，美國，色譜純)，水為純化水(怡寶水)，未加碘精制鹽(廠家：中鹽榆林有限公司；批號：201707041S)其余試劑為分析純。

2 分析方法與結果

2.1 含量測定方法

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸小檗堿、木蘭花堿、鹽酸小檗紅堿、黃柏堿、巴馬汀、藥根堿、3.5-O-二咖啡酰奎酸、異綠原酸B、黃柏內酯25.46、10.88、7.51、9.66、10.10、11.09、8.55、6.43、9.25 mg，分別置 10 mL 量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得各對照品儲備液。精密移取各生物堿對照品儲備液1 mL，置 10 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度。得到鹽酸小檗堿、木蘭花堿、鹽酸小檗紅堿、黃柏堿、巴馬汀、藥根堿質量濃度分別為249.5、106.6、73.6、91.7、99.0、99.1 μg/mL 的混合對照品溶液。置4℃的冰箱中保存備用。

2.1.2 HLPC色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-3 5 μm 4.6×250 mm；流相：乙腈A-0.1%磷酸B(15∶85、PH=2.10)，進行梯度洗脫(見表1)；柱溫：30 ℃；流速：1.0 ml/min，進樣量：5 μL；檢測波長：327 nm。

表1 梯度洗脫表

圖1 不同炮制溫度下鹽黃柏三類主要成分HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprint of three main components of Phellodendron chinensis under different processing temperatures注：S1 120 ℃；S2 140 ℃；S3 160 ℃；S4 180 ℃；S5 200 ℃；1 異綠原酸B；2 3.5-O-二咖啡酰奎酸；3黃柏內酯；4黃柏堿；5木蘭花堿；6藥根堿；7巴馬汀；8鹽酸小檗紅堿；9鹽酸小檗堿。Note:S1 120 ℃；S2 140 ℃；S3 160 ℃；S4 180 ℃；S5 200 ℃；1 Isochlorogenic acid B； 2 3.5-Isochlorogenic acid；3 obakulactone;4 Phellodendrine;5 magnoflorine；6 jateorhizine;7 palmatine;8 berberubine;9 berberine.

2.1.3 供試品溶液得制備

精密稱取鹽黃柏藥材粉末(過三號篩)1.0 g，置100 mL錐形瓶中，精密加入25 mL鹽酸：甲醇(1∶100)混合溶液，稱定重量，超聲處理1 h，冷卻后加入鹽酸：甲醇(1∶100)混合溶液，補足失去的重量，靜置，取上清液過0.45 μm濾膜，即得供試品溶液。

2.2 單因素炮制工藝考察

2.2.1 炮制溫度考察

稱取100 g黃柏飲片10份，按每 100 g 藥材加入2 g未加碘精制鹽的比例，分別加入40 mL水將2 g鹽溶解，用噴壺均勻噴灑在藥材表面，并置密閉容器中悶潤60 min，分別120、140、160、180、200 ℃炮制15 min，粉碎，按2.1.3進行含量測定。記錄峰面積，計算含量，結果見表2、圖1。

表2 炮制溫度對鹽黃柏指標成分含量影響(mg/g)

實驗過程發現，炮制溫度對鹽黃柏得炮制有一定影響，特別是鹽酸小檗紅堿的含量，隨著溫度得升高，鹽酸小檗紅堿含量增加，以及內酯成分亦有所提高，并且溫度過低，鹽黃柏不易炒干，但溫度過高容易炒焦，故綜合考慮，最終確定鹽黃柏炮制溫度范圍為120～180 ℃。

2.2.2 炮制時間考察

稱取100 g黃柏飲片10份，按每100 g 藥材加入2 g鹽的比例，分別加入40 mL水將2 g鹽溶解，用噴壺均勻噴灑在藥材表面，并置密閉容器中悶潤90 min，在150 ℃炮制10、15、20、25、30 min，粉碎，按2.1.3進行含量測定。記錄峰面積，計算含量，結果見表3、圖2。

結論：鹽黃柏炮制時間不同，生物堿總量變化較小，但個別成分得含量變化較大，炮制溫度不同，炮制時間亦有相應調整，但為節約生產成本，應將其炒藥時間控制在30 min以內，并且時間過長，會使黃柏飲片炒焦，此外，時間太短，鹽黃柏未炒干，會影響黃柏的儲存，綜上所述，本實驗最終確定時間范圍為15～25 min。

圖2 不同炮制時間下鹽黃柏三類主要成分HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of three main components of Phellodendron chinensis under different processing time注：S1 10 min；S2 15 min；S3 20 min；S4 25 min；S5 30 min；1 異綠原酸B；2 3.5-O-二咖啡酰奎酸；3黃柏內酯；4黃柏堿；5木蘭花堿；6藥根堿；7巴馬汀；8鹽酸小檗紅堿；9鹽酸小檗堿。Note:S1 10 min；S2 15 min；S3 20 min；S4 25 min；S5 30 min；1 Isochlorogenic acid B； 2 3.5-Isochlorogenic acid;3 obakulactone；4 Phellodendrine;5 magnoflorine;6 jateorhizine；7 palmatine;8 berberubine;9 berberine.

炮制時間Processed temperature(min)生物堿總量Alkaloid3.5-O-二咖啡酰奎酸 3.5-Isochlorogenic acid異綠原酸BIsochlorogenic acid B黃柏內酯Obakulactone水分Water(%)10 min-160.819537.38651.47048.152925.36 10 min-253.592834.31061.43727.605525.7515 min-157.390936.97321.44438.062418.74

續表3(Continued Tab.3)

炮制時間Processed temperature(min)生物堿總量Alkaloid3.5-O-二咖啡酰奎酸 3.5-Isochlorogenic acid異綠原酸BIsochlorogenic acid B黃柏內酯Obakulactone水分Water(%)15 min-254.974735.01811.33857.824018.7620 min-157.272536.23131.49188.035912.2020 min-254.094535.25151.35627.595212.9825 min-154.951238.01611.34537.416310.4425 min-258.079639.07761.43548.028910.4230 min-152.659234.05341.34158.12837.2730 min-253.738634.32421.38267.52607.31

2.2.3 炒藥量考察

分別取生黃柏飲片50、100、150、200、250、300 g飲片各2份，分別按每100 g藥材加入40 mL水(含2 g鹽)的比例，浸潤60 min，150℃炮制15 min，粉碎，按2.1.3進行含量測定。記錄峰面積，計算含量。結果見表4、圖3。

實驗結果表明，炒藥量對各類成分影響較小，炒藥量對炮制品的影響主要與所配置機器容量得總體積相關，調查多個藥廠，根據多名炒藥師傅多年炮制經驗，炒藥量一般不多于炒藥機總容量1/4，本實驗所用炒藥機所容納黃柏飲片總量約為1 200 g,炒藥量太少容易炒焦甚至炒碳，影響飲片質量，炒藥量過多容易造成飲片翻炒不均勻，部分飲片未炒干，影響飲片的儲存，最終確定正交炒藥范圍為100 g～300 g。

圖3 不同炒藥量下鹽黃柏三類主要成分HPLC指紋圖譜Fig.3 HPLC fingerprint of three main components of Phellodendron chinensis under different processing amount注：S1 50g；S2 100g；S3 150g；S4 200g；S5 250g；1 異綠原酸B；2 3.5-O-二咖啡酰奎酸；3黃柏內酯；4黃柏堿；5木蘭花堿；6藥根堿；7巴馬汀；8鹽酸小檗紅堿；9鹽酸小檗堿。Note:S1 50g；S2 100g；S3 150g；S4 200g；S5 250g；1 Isochlorogenic acid B； 2 3.5-Isochlorogenic acid;3 obakulactone;4 Phellodendrine;5 magnoflorine;6 jateorhizine;7 palmatine;8 berberubine;9 berberine.

炒藥量Processed amount(g)生物堿總量Alkaloid3.5-O-二咖啡酰奎酸 3.5-Isochlorogenic acid異綠原酸BIsochlorogenic acid B黃柏內酯Obakulactone50g-142.730829.90811.04534.586750g-241.741829.71231.45874.7394100g-144.844432.67351.09655.0910100g-243.376531.89351.00995.2639150g-142.966328.43001.00095.0139150g-242.082029.50220.96905.2438200g-141.596927.24290.99115.3217200g-242.239629.10611.05065.0719250g-139.982127.39800.80985.4976250g-245.685228.75171.06336.1125

2.3 AHP法確定各指標成分權重

根據各成分藥效作用以及各成分含量多少，將指標成分含量作為權重予以量化，即將4個指標成分分成4個層次，并確定各指標得優先順序：生物堿總量>3.5-二咖啡酰奎酸>黃柏內酯>異綠原酸B。以此構成成對比較的優先矩陣，并獲得各指標的相對評分，指標成對比較的判斷優先矩陣見表5。

表5 指標成對比較的判斷優先矩陣

根據表5評分結果，AHP法計算生物堿總量、3.5-二咖啡酰奎酸、黃柏內酯、異綠原酸B各項指標權重系數分別為0.466 8、0.277 6、0.160 3、0.095 3，一致性比例因子CR=0.007 3<0.1,即指標優先比較判斷矩陣具有一致性，權重系數有效。

2.4 正交設計優選炮制工藝

根據單因素實驗，優選炒制溫度、炒制時間、炒藥量三個因素三水平優選炮制工藝。根據因素和水平數，選擇L9(34)正交表。因素、水平設定和實驗安排見下表。

表6 正交因素水平表

表7 正交實驗安排與結果

2.5 提取工藝的確定

采用AHP法得到的權重系數對實驗結果進行綜合評分，利用SPSS 19.0對正交結果進行分析，直觀分析結果見表8，方差分析結果見表9。

表8 正交試驗綜合評分結果

表9 方差分析

注：F0.05(2,2)=99.0。

Note:F0.05(2,2)=99.0.

圖4 正交實驗HLPC指紋圖譜Fig.4 HLPC fingerprint of orthogonal design

正交實驗結果表明，不同的炮制工藝對鹽黃柏個別成分影響較大，直觀分析表明，影響炮制工藝的主次為：A>C>B，A因素對綜合評分具有顯著影響，得最佳工藝為A3B3C2，但由于B因素和C因素對實驗結果影響不顯著，考慮工業化大生產，為節約成本，同時保證飲片炒干，最終確定炮制工藝為：A3B2C3，即180 ℃，炒20 min，加入容器體積1/4飲片量。

2.6 正交驗證試驗

稱取300g黃柏飲片(三份)，分別加入80 mL鹽水(含4 g鹽)，悶潤90 min，放入預熱至180 ℃炒藥機翻炒20 min，粉碎，過篩，按“2.1項”進行含測。實驗結果表明，RSD<5%，該工藝穩定、可行，可運用于鹽黃柏炮制工藝生產。

表10 驗證結果

3 討論

3.1 指紋圖譜分析

試驗發現鹽黃柏不同炮制品均存在這9個共有峰，但各成分含量有一定差異。不同炮制品中生物堿總量變化較小，主要變化成分為鹽酸小檗紅堿及黃柏內酯。鹽酸小檗紅堿可能是由于加熱使某些成分發生了轉變，研究發現黃柏炮制后，小檗紅堿含量增加是由鹽酸小檗堿轉化而來。但不同炮制溫度對化學成分的轉化有所不同，研究發現，加碘鹽和非加碘鹽黃柏內酯含量相差較大，其主要原因可能是碘使其溶出率的變化所致。黃柏生熟藥效有異，生品性寒而沉；鹽炙后緩和苦燥之性，不傷脾胃，引藥下行入腎，增強資腎陰、瀉腎火的作用。通過指紋圖譜比較，發現黃柏炮制前后存在化學成分的變化，這可能是導致其藥效發生變化的原因。[4]

3.2 鹽黃柏飲片質量評價

實驗結果表明，不同鹽黃柏炮制品各類成分含量不呈正比趨勢增長，故以單一成分來評價藥材質量的優劣是不全面的，需多成分，多指標進行綜合考慮。本實驗通過三類有效成分的精確定量測定，為鹽黃柏藥材質量的控制和評價提供更好技術參考[5-7]，并結合指紋圖譜，定性定量得反映鹽黃柏質量，為本課題接下來進一步鹽黃柏的炮制工藝參數研究奠定基礎。

3.3 炮制工藝的確定

本實驗初期采用單因素實驗，確定各影響因素的范圍，[8]篩選出對鹽黃柏質量影響較大的炮制影響因素，并采用正交設計進一步優選，實驗結果采用多成分、多方面評價，[9]使篩選工藝更具科學性、可行性，所篩選的工藝對鹽黃柏炮制穩定、可行，適用于實際生產中進一步驗證，同時該試驗為闡釋黃柏的炮制機理提供了一定的參考依據，所建立的方法也可用于鹽黃柏的質量控制。