枳實(shí)中辛弗林分離純化及其標(biāo)準(zhǔn)樣品定值與不確定度研究

林 濤，邵金良，李茂萱 ，鄒艷虹，楊東順，劉興勇，劉宏程*

1云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所；2農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室，昆明 650205

辛弗林是枳實(shí)中的主要活性成分之一，枳實(shí)是從蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)的幼果經(jīng)干燥后所得[1]。辛弗林具有逐風(fēng)理氣，促進(jìn)食欲等藥理作為[2]，辛弗林無(wú)副作用和陽(yáng)性反應(yīng)[3]，常作為天然興奮劑及減肥藥物中的有效成分而廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品等保健品行業(yè)[4,5]。

鑒于辛弗林較好的功能活性，其在枳實(shí)藥材、柑橘類水果品質(zhì)評(píng)價(jià)方面具有重要的作用[6-8]。近年來(lái)，對(duì)于辛弗林的研究主要包括了提取工藝[9,10]和測(cè)定方法[11-15]方面的研究，這些研究都是基于辛弗林對(duì)照品而展開(kāi)的，但是這些對(duì)照品的純度較低，缺乏嚴(yán)格的定值程序，純度量值準(zhǔn)確度較低，無(wú)法滿足標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求，嚴(yán)重限制了相關(guān)產(chǎn)品中辛弗林的準(zhǔn)確定量及相關(guān)的品質(zhì)分析、質(zhì)量評(píng)價(jià)等方面的研究。因此，為了提高辛弗林分析測(cè)定的準(zhǔn)確度和質(zhì)量評(píng)價(jià)的一致性等，開(kāi)展辛弗林標(biāo)準(zhǔn)樣品的研究具有十分重要的意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

制備色譜：P270Ⅱ，大連依利特公司；高效液相色譜儀：Alliance 2695e型，美國(guó)Waters公司；氣相色譜儀：TRACE 1310型，附帶TriPlus? 300型頂空自動(dòng)進(jìn)樣器，氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)，美國(guó)Thermo Fisher公司；質(zhì)譜儀：API 4000型，美國(guó)AB公司；核磁共振譜儀：AVANCEⅢ 600 MHz型，美國(guó)Bruker公司；紅外光譜儀：NICOLET NEXUS 470FT-IR型，美國(guó)熱電公司；熱重分析儀：Pyris1 TGA型，美國(guó)Perkin Elmer公司；卡爾費(fèi)休水分滴定儀：TOLEDO DL39型，瑞士METTLER TOLEDO公司；XBridge BEH C18OBD色譜柱，19 mm × 250 mm，5 μm，美國(guó)Waters公司；CAPCELL PAK MGⅡC18色譜柱：4.6 mm×250 mm，5.0 μm，日本Shiseido公司；電子分析天平：AE-100型，瑞士METTLER TOLEDO公司；超聲波清洗機(jī)：KQ5200DA型，昆山市超聲儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：Hei-VAP Value Digital型，德國(guó)海道夫公司。

枳實(shí)樣品：購(gòu)于云南省昆明市藥材市場(chǎng)；AB-8大孔吸附樹(shù)脂：上海源葉生物科技有限公司；尼泊金乙酯：純度99.7%，國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)樣品，編號(hào)為GBW(E)100064，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；氘代甲醇：美國(guó)Sigma公司；95%乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)太倉(cāng)滬試試劑有限公司；氨水：分析純，25.0%～28.0%，國(guó)藥集團(tuán)太倉(cāng)滬試試劑有限公司；甲醇：色譜純，德國(guó)Merck公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 辛弗林純度標(biāo)準(zhǔn)樣品的分離純化

參照文獻(xiàn)[16]中的提取和分離純化方法，稱取枳實(shí)粉約5 kg，加入30 L純水后80 ℃超聲提取2次后將提取液合并后減壓濃縮后得到枳實(shí)水提物1.0 kg，再加入20 L純水復(fù)溶后，利用氨水調(diào)節(jié)pH至7.5左右，上樣量為3 BV，流速為2 BV/h，純水洗脫至無(wú)色后，利用20%乙醇以1 BV/h的流速洗脫，收集洗脫液至3 BV，濃縮干燥后利用甲醇復(fù)溶，利用制備色譜進(jìn)一步純化，制備色譜條件：流動(dòng)相為甲醇:水(15∶85)，進(jìn)樣量：2 mL；流速：15 mL/min；柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm。經(jīng)制備色譜純化得到辛弗林標(biāo)準(zhǔn)樣品候選物3 g。

1.2.2 定性分析

采用紅外光譜、質(zhì)譜紫外和核磁分別對(duì)辛弗林標(biāo)準(zhǔn)樣品候選物的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征與鑒定。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)樣品分裝

辛弗林標(biāo)準(zhǔn)樣品經(jīng)定性確證后，利用2 mL棕色廣口鉗口瓶進(jìn)行分裝，分裝150瓶，每瓶為10 mg，低溫下儲(chǔ)存。

1.2.4 均勻性檢驗(yàn)

均勻性檢驗(yàn)的步驟參照GB/T 15000-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則》，分別從已分裝的辛弗林中隨機(jī)抽取20瓶，利用甲醇配制為1.0 mg/mL濃度的溶液，利用液相色譜進(jìn)行分析測(cè)定，每瓶測(cè)定3次，并利用液相色譜-面積歸一化法計(jì)算辛弗林的含量，同時(shí)進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)(F檢驗(yàn))。

1.2.5 穩(wěn)定性考察

1.2.5.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察。長(zhǎng)期穩(wěn)定性考察時(shí)間采用先密后疏的原則，分別在第0、1、3、6個(gè)月進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè)。檢驗(yàn)方法與均勻性檢驗(yàn)相同，即液相色譜-面積歸一化法，操作步驟為：每次考察時(shí)分取2個(gè)包裝，每個(gè)包裝用甲醇配制為濃度1.0 mg/mL的溶液進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)包裝平行測(cè)定3次并計(jì)算平均值，再將2個(gè)包裝的測(cè)定結(jié)果平均值作為最終的檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

1.2.5.2 短期穩(wěn)定性考察。短期穩(wěn)定性考察也是遵循先密后疏的原則，分別于第0、3、5、7、14天進(jìn)行樣品的穩(wěn)定性考察。為了模擬長(zhǎng)途運(yùn)輸過(guò)程中的溫度，各取20個(gè)包裝分別置于20 ℃和40 ℃的恒溫箱中儲(chǔ)存并定期檢驗(yàn)，檢驗(yàn)方法與均勻性檢驗(yàn)相同。

1.2.6 辛弗林標(biāo)準(zhǔn)樣品定值

根據(jù)GB/T 15000-2008《標(biāo)準(zhǔn)樣品工作導(dǎo)則》的規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)樣品定值時(shí)需采用兩種不同原理的方法進(jìn)行定值。因此，本研究中根據(jù)辛弗林的相關(guān)物理和化學(xué)性質(zhì)，選取質(zhì)量平衡法和定量核磁法兩種不同原理方法對(duì)辛弗林標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行定值，具體方法如下。

1.2.6.1 質(zhì)量平衡法的測(cè)定方法參考文獻(xiàn)[17-21]中的方法，主要包括了利用液相色譜-面積歸一化法進(jìn)行主成分含量分析、卡爾費(fèi)休庫(kù)倫法測(cè)定水分含量、TGA法測(cè)定灰分含量、頂空氣相色譜法測(cè)定揮發(fā)性雜質(zhì)含量以及利用ICP-MS測(cè)定無(wú)機(jī)元素含量等，按式(1)計(jì)算辛弗林的純度。

P1=P0×(1-Xw-Xn-Xv)×100%

(1)

式中：P1——樣品純度，%；

P0——辛弗林的含量，%；

Xw——水分含量，%；

Xn——非揮發(fā)性雜質(zhì)含量，%；

Xv——揮發(fā)性雜質(zhì)含量，%。

1.2.6.2 核磁定量法主要步驟：分別稱取辛弗林純度標(biāo)準(zhǔn)樣品和尼泊金乙酯4.2 mg和5 mg，再加入0.5 mL氘代甲醇溶解，混勻后1H-NMR測(cè)定。按式(2)計(jì)算辛弗林的純度。

式中：P2——采用核磁共振法測(cè)得的被測(cè)物的純度，%；

Ix——樣品指定峰的積分面積，%；

Istd——內(nèi)標(biāo)物指定峰的積分面積；

nstd——內(nèi)標(biāo)物指定峰的核群核個(gè)數(shù)；

nx——樣品指定峰的核群核個(gè)數(shù)；

Mx——樣品的相對(duì)分子質(zhì)量；

Mstd——內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)分子質(zhì)量；

mstd——內(nèi)標(biāo)物添加的質(zhì)量；

mx——樣品的稱樣量；

Pstd——內(nèi)標(biāo)物的純度，%。

1.2.7 不確定度研究

不確定度uCRM主要包括了標(biāo)準(zhǔn)樣品定值過(guò)程引入的不確定度uchar、均勻性引入的不確定度ubb、短期穩(wěn)定性引入的不確定度ults和長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度usts四個(gè)部分，相關(guān)計(jì)算公式如下：

ults=s(blts)×t

ustd=s(bstd)×t

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 定性結(jié)果分析

2.1.1 紅外光譜分析

辛弗林的紅外光譜如圖1所示，3 393.30 cm-1特征峰為O-H的伸縮振動(dòng)峰，2 949.72和2 870.50 cm-1特征峰為CH3和CH2的伸縮振動(dòng)峰，1 004.52

圖1 辛弗林的紅外光譜Fig.1 Infrared spectrum of synephrine

～1 604.95 cm-1提示為單、雙鍵的伸縮振動(dòng)區(qū)，其中1 247.88、1 159.59和1 057.62 cm-1為C-O的伸縮振動(dòng)。

2.1.2 紫外光譜分析

辛弗林的紫外光譜如圖2所示，辛弗林在190 nm和220 nm處具有較強(qiáng)的紫外吸收，其中190 nm提示結(jié)構(gòu)中含有R-OH結(jié)構(gòu)。

圖2 辛弗林的紫外光譜Fig.2 UV spectrum of synephrine

2.1.3 質(zhì)譜分析

通過(guò)對(duì)辛弗林進(jìn)行質(zhì)譜分析，在正離子模式下，掃描范圍為100～300m/z，圖3所示，其母離子167.8m/z為[M+H]+，初步確定為辛弗林。

圖3 辛弗林質(zhì)譜圖Fig.3 The mass spectrum of synephrine

2.1.4 核磁分析

通過(guò)對(duì)辛弗林的氫譜和碳譜分析，化學(xué)位移歸屬為：1H NMR (Methanol-D4,600 MHz):δ2.40 (s,3H,CH3-N);δ2.64～2.789 (m,2H,CH2-N);δ4.67 (dd,1H;J=6.0;J=6.0,CH-O);δ6.76 (d,2H,J=6.0 Hz,ArCH);δ7.19 (d,2H,J=12.0 Hz,ArCH);13C NMR (Methanol-D4,150 MHz):δ35.9 (CH3-N);δ59.9 (CH2-N);δ72.9 (CH-OH);δ116.2 (ArCH);δ128.3 (ArCH);δ135.1 (ArC0);δ158.3 (ArCH-OH)。與文獻(xiàn)中辛弗林的氫譜和碳譜進(jìn)行比較，其核磁數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]一致，結(jié)合紅外、紫外和質(zhì)譜信息，可確定其為辛弗林。

2.2 均勻性檢驗(yàn)結(jié)果

圖4 辛弗林核磁譜Fig.4 The nuclear magnetic spectrum of synephrine

2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果

利用趨勢(shì)分析法對(duì)穩(wěn)定性的結(jié)果進(jìn)行考察，如圖5所示。通過(guò)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行t 檢驗(yàn)，根據(jù)判定公式，穩(wěn)定性分析中所擬合的直線斜率絕對(duì)值應(yīng)小于t(0.95，n-2)×斜率的不確定度，結(jié)果如表1所示，短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果均符合要求。因此辛弗林標(biāo)準(zhǔn)樣品在6個(gè)月內(nèi)的穩(wěn)定性較好，且模擬運(yùn)輸條件下的特性量值穩(wěn)定。

2.4.1 質(zhì)量平衡法定值結(jié)果

(1)液相色譜-面積歸一化法測(cè)定含量：采用優(yōu)化后的色譜條件：色譜柱：資生堂C18色譜柱，5 μm，4.0×250 mm；流動(dòng)相為甲醇:水(10:90)，進(jìn)樣量：10 μL；流速：0.5 mL/min；柱溫：30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，辛弗林的液相色譜圖如圖6所示。

(2)采用卡爾費(fèi)休庫(kù)倫法測(cè)定了水分含量、頂空氣相色譜法測(cè)定了揮發(fā)性雜質(zhì)含量和ICP-MS測(cè)定了無(wú)機(jī)元素含量等，結(jié)果如表2所示，質(zhì)量平衡法測(cè)定的純度質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.55%。

2.4 定值結(jié)果

2.4.2 核磁定量法定值結(jié)果

根據(jù)尼泊金乙酯和辛弗林在氫譜中的化學(xué)位移，選擇了尼泊金乙酯化學(xué)位移1.35 ppm和辛弗林化學(xué)位移2.45 ppm處的氫作為定量的目標(biāo)峰，7次測(cè)定的結(jié)果分別為99.689%、99.695%、99.689%、99.691%、99.693%、99.688%和99.690%，平均值為99.691%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.002%。

表1 辛弗林純度的穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果(%)

圖5 穩(wěn)定性趨勢(shì)分析圖Fig.5 Trend analysis of stability analysis

編號(hào)No.主成分純度Principal component purity(%)水分含量Moisture content(%)揮發(fā)性物質(zhì)Volatile matter(%)無(wú)機(jī)非揮發(fā)性物質(zhì)Inorganic non-volatiles(%)純度定值Purity palue(%)199.7650.0542-0.174 699.545299.7780.0533-0.173 499.539399.7740.0551-0.172 499.569499.7680.0549-0.176 299.540599.7640.0547-0.173 799.555699.7730.0539-0.174 599.532799.7860.0542-0.171 499.544平均值A(chǔ)verage99.7720.0544-0.173 799.546標(biāo)準(zhǔn)偏差Std Dev0.007 8%1.23%-10.670%0.013 6%

圖6 辛弗林液相色譜圖Fig.7 Liquid chromatogram of synephrine

圖7 辛弗林定量核磁氫譜Fig.7 Quantitation 1H-NMR of synephrine

2.4.3 兩種方法定值結(jié)果

根據(jù)質(zhì)量平衡法和核磁定量法的定值結(jié)果分別為99.546%和99.691%，可以得到最終的定值結(jié)果為(99.546%+99.691%)/2=99.618%。

2.5 不確定度評(píng)定結(jié)果

2.5.2 不穩(wěn)定引入的不確定度：根據(jù)表1的結(jié)果，辛弗林純度標(biāo)準(zhǔn)樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性引入的不確定度為ults=0.009%，辛弗林純度標(biāo)準(zhǔn)樣品短期穩(wěn)定性引入的不確定度分別為20 ℃的usts,20 ℃=0.004%和40 ℃的usts,40 ℃=0.002%，短期穩(wěn)定性引入的總的不確定度為usts=0.004 5%。

2.5.3 液相色譜法定性的測(cè)量重復(fù)性引入的不確定度u1，由測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算為0.007 8%；雜質(zhì)在不同檢測(cè)波長(zhǎng)下響應(yīng)差異引入的不確定度u2，本研究中的辛弗林中的雜質(zhì)的最大吸收波長(zhǎng)與主成分一致，可將u2忽略不計(jì)；儀器檢測(cè)線性引入的不確定度u3，本研究中辛弗林在0.05～500.00 mg/L的濃度范圍內(nèi)線性良好(相關(guān)系數(shù)為0.999 5)，可將u3忽略不計(jì)；儀器檢出限引入的不確定度u4，通過(guò)試驗(yàn)可以得到儀器的檢出限為0.40 mg/L，u4=0.40/500.00=0.08%。

2.5.5 根據(jù)質(zhì)量平衡法的不確定度uMB的計(jì)算公式，可計(jì)算得到uMB=0.17%。

3 結(jié)論

本研究采用大孔樹(shù)脂及制備色譜等現(xiàn)代分離純化手段，從枳實(shí)中分離得到辛弗林，采用質(zhì)量平衡法和定量核磁法兩種不同原理的定值方法對(duì)辛弗林進(jìn)行定值以及均勻性、穩(wěn)定性和不確定度研究，辛弗林標(biāo)準(zhǔn)樣品的定值結(jié)果為99.62%，其擴(kuò)展不確定度為0.8%(k=2)，滿足國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)樣品的要求，對(duì)于相關(guān)樣品中辛弗林的測(cè)定具有重要意義。