附子不同組分抗急性心力衰竭大鼠的實驗研究

陳海媚，陳秋伶，李夢婷，謝曉芳*，彭 成*

1成都中醫藥大學藥學院；2中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，成都 611137

急性心力衰竭(Acute heart failure,AHF)系指急性的心臟病變引起心肌收縮力明顯降低或心室負荷加重而造成急性心排血量驟降，體循環或肺循環壓力突然增高，周圍循環阻力增加，最終導致組織器官灌注不足，急性臟器淤血的臨床綜合征。臨床上以急性左心衰竭最為常見，表現為急性肺淤血、肺水腫，嚴重時出現心源性休克，其發生與交感神經系統和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(RAAS)興奮[1]、炎性細胞因子高表達[2]、血管內皮功能失常[3]、細胞能量缺失及信息傳遞系統障礙[4]等有關，現代醫學的治療手段也從早期單純的強心、利尿、擴血管逐步轉變為調節神經內分泌系統。

傳統中藥附子具有回陽救逆，補火助陽，散寒止痛的功效，尤能救治亡陽重證，被譽為“回陽救逆第一要藥”。現代藥理和臨床研究顯示，附子[5]及相關產品[6,7]，以及附子與干姜[8]、人參[9]配伍都具有強心、改變血流動力學、緩解心衰的治療作用，具體表現在抑制血管緊張素以擴張血管，降低醛固酮含量以增強血管彈性，調節RAAS系統以減輕心臟負荷[10]，激動α、β腎上腺素能受體[11]以及調控PI3K-Akt/Jak-STAT通路[12]以改善心肌功能等，這也是對附子“回陽救逆”功效的科學解釋。但其強心作用主要成分及機制尚存爭議，本實驗旨在從急性心力衰竭模型大鼠的血流動力學和神經體液因子兩方面來篩選附子的強心組分，探索更多可能的強心物質基礎，為相關研究提供參考和支持。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

健康成年SD大鼠，SPF級，雌雄各半，由四川省中醫藥科學院實驗動物研究中心提供，質量合格證號：SCXK(川)2013-15。動物實驗環境：成都中醫藥大學國家中醫藥管理局中藥藥理科研三級實驗室(TCM-2009-315)。

1.2 藥物與試劑

生附片：購自四川江油中壩科技發展有限公司，經本校生藥鑒定教研室高繼海副教授鑒定為烏頭Aconitumcamichaeli.Debx的子根。附子總生物堿、水溶性生物堿、脂溶性生物堿、多糖以及脂溶性成分用蒸餾水配置成高、低二個劑量組(10 g生藥/kg、5 g生藥/kg)，4 ℃儲存，備用。

鹽酸普羅帕酮注射液(廣州白云山明興制藥有限公司生產，批號：171101)；參附注射液(華潤三九藥業有限公司，批號：16111101002)；肝素鈉(成都市海通藥業有限公司，效價150 u/mg，批號：170904)；烏來糖(成都市科龍化工試劑廠，批號：20130323)；氯化鈉注射液(四川科倫藥業有限公司，批號：L117110808)；Rat Ang-I ELISA Kit(Elabscience，批號：AK0018APR24012)；Rat Ang-II ELISA Kit(Elabscience，批號：AK0018APR24014)；Rat TNF-α ELISA kit(Elabscience，批號：AK0018APR24010)；Rat ANP ELISA Kit(Elabscience，批號：AK0018APR24008)。

1.3 儀器

BL-420生物機能實驗系統(成都泰盟科技有限公司)；Varioskan Flash 2.4.3全波長多功能讀數儀(美國Thermo公司)；離心機(Beckman Coulter，型號：Allegra X-30R Centrifuge)；壓力換能器等。

2 實驗方法

2.1 附子不同組分的提取方法

據文獻報道[13]，酸水有利于附子生物堿的提取，故本實驗采用0.1 mol/L鹽酸提取附子總生物堿，濃縮提取液，調節pH = 3，酸水液通過苯乙烯系強酸型陽離子交換樹脂，以9%氨水-70%乙醇進行洗脫，減壓回收氨水乙醇，即得附子總生物堿。附片粗粉經石油醚回流提取后，回收提取液，得附子脂溶性成分。5% Na2CO3浸潤附片中粉，二氯甲烷加熱回流提取，回收二氯甲烷，0.05 mol/L H2SO4萃取，將萃取所得酸水液加氨水調節pH=9～10，再用二氯甲烷萃取，回收二氯甲烷，得到附子脂溶性生物堿；揮干藥渣中的二氯甲烷，加水回流提取，過濾，濃縮藥液，加入高濃度乙醇，攪拌，靜置至沉淀完全，回收乙醇至無醇味，加水稀釋藥液，調節pH = 3，再通過苯乙烯系強酸性陽離子交換樹脂，用9%氨水溶液洗脫，得到水溶性生物堿液，蒸干即可；除去醇沉后沉淀中的蛋白質，加水加熱溶解，加入氯仿-正丁醇溶液，靜止分層，水相濃縮即得附子多糖。

2.2 大鼠急性心衰模型的建立

取健康成年SD大鼠，雌雄各半，腹腔注射烏來糖125 mg/kg，待大鼠麻醉后使其仰臥，固定四肢，縱向將其頸部腹側偏右的皮膚剪開，于胸鎖乳突肌內側分離左頸總動脈，手術線結扎遠心端，動脈夾夾住近心端，將充滿肝素鈉的導管沿頸動脈往心室方向插入，保證導管自由進出且切口處沒有血液滲出，隨即取掉動脈夾。后將導管插入左室腔，當感到導管隨心臟搏動而明顯抖動時，則應減慢插進速度。當顯示器上的波形由血壓波變成下沿達0 mm Hg附近具有明顯舒張期而峰頂平坦的波形時表明導管已經通過主動脈瓣進入左室腔內，此時再送入導管約0.1～0.3 cm，待波形平穩后，用動脈夾將導管固定于胸鎖乳突肌上。傳出的信號均同步記錄在四道生理記錄儀上，觀察并記錄一段正常值后，于股靜脈緩慢注入鹽酸普羅帕酮注射液(3.33 mL/kg)并觀察生理記錄儀上的波形，當+dp/dtmax下降到正常值的2/3時，且維持5分鐘以上無明顯上升趨勢時，即視為急性心衰模型形成[14]。

2.3 大鼠心臟功能測定

將造模后的大鼠隨機分組(n=8)，分為模型對照組(蒸餾水)、陽性對照組(參附注射液3.33 mL/kg)、附子不同成分給藥組(總生物堿、水溶性生物堿、脂溶性生物堿、脂溶性成分和多糖高、低劑量組，即10 g生藥/kg和5 g生藥/kg)。造模穩定后給藥，其中陽性對照組股靜脈注射給藥，其余各組十二指腸給藥。觀察造模前后以及給藥后5、10、20、30、60 min的HR及+dp/dtmax、-dp/dtmax值的變化情況。

2.4 大鼠血清神經體液因子測定

將觀察60 min后的各組大鼠進行腹主動脈取血，另取空白組(n=8)以同樣的方式采血，離心15 min(4 000 rpm)，取血清，采用酶聯免疫法測定血清測定Ang-I、Ang-II、ANP、TNF-α含量。

2.5 統計學處理

圖1 附子不同組分對急性心衰大鼠左心室內壓圖的影響Fig.1 Effects of different components on left ventricular pressure chart of rats with acute heart failure注：A.造模前；B.造模后；C.參附注射液陽性組；D.附子總生物堿高劑量組；E.附子水溶性生物堿高劑量組；F.附子脂溶性生物堿高劑量組；E.附子多糖高劑量組；F.附子脂溶性成分高劑量組。Note:A.before modeling;B.after modeling;C.ShenFu injection;D.high dose of total alkaloids;E.high dose of water-soluble alkaloids；F.high dose of fat-soluble alkaloids;G.high dose of polysaccharides;H.high dose of fat-soluble components.

3 實驗結果

3.1 對急性心衰大鼠左心室內壓圖的影響

正常大鼠經左心室插管后，在生理記錄儀上顯示出具有一定規律的心室內壓波形圖，且HR、+dp/dtmax和-dp/dtmax值穩定。經鹽酸普羅帕酮注射液造模后，左心室內壓波形圖波間距增加，波形變矮變寬，心室HR、+dp/dtmax明顯下降，心室內壓-dp/dtmax上升。經過一定時間后，波形圖、HR、+dp/dtmax、-dp/dtmax值均有一定程度的恢復，各給藥組恢復程度均優于模型組，且參附注射液陽性組和附子總生物堿高劑量組基本可恢復到造模前。各組心室內壓變化詳見圖1。

3.2 對急性心力衰竭大鼠HR的影響

以大鼠造模前后自身頻率差值(正常值﹣造模后值)為統計量做單因素方差分析，發現大鼠造模后HR值下降，表示心臟搏動次數減少，隨著時間的延長減小的幅度逐漸縮小，但仍低于正常值。給藥后，參附注射液組和各給藥組均有升高HR值的趨勢，以總生物堿高劑量組作用最為明顯，其HR基本可恢復到造模前。與模型對照組比較，總生物堿高劑量組在各時間點均有顯著性差異(P< 0.01)；總生物堿低劑量組、水溶性生物堿高、低劑量組在給藥后5、10、20、30 min時，具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；脂溶性生物堿高、低劑量組在各時間點均無顯著性差異；多糖高劑量組在給藥后10、20、30 min時，具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，多糖低劑量組在給藥后5、10、20 min時，具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；脂溶性成分高劑量組在給藥后10、20、30、60 min時，具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，脂溶性成分低劑量組在給藥后10、20、30 min時，具有顯著性差異(P<0.01)。詳細結果見表1。

表1 附子不同組分對急性心衰大鼠心臟頻率的影響

注：與模型對照比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Composed with model group,*P<0.05,**P<0.01.

3.3 對急性心衰大鼠左心室內壓最大上升速率+dp/dtmax和最大下降速率-dp/dtmax的影響

大鼠造模后+dp/dtmax顯著降低，以大鼠造模前后(正常值-造模后值)+dp/dtmax為統計量做單因素方差分析，參附注射液組、總生物堿組和水溶性生物堿組具有一定升高+dp/dtmax的趨勢。與模型對照組比較，總生物堿高劑量組在給藥后5、10、20 min時，具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，總生物堿低劑量組在給藥后10 min時，具有顯著性差異(P<0.05)；水溶性生物堿高劑量組在給藥后5、10 min時，具有顯著性差異(P<0.05)，水溶性生物堿低劑量組在給藥后10 min時，具有顯著性差異(P<0.05)；多糖低劑量組在給藥后10 min時，具有顯著性差異(P<0.05)。詳細結果見表2。

大鼠造模后-dp/dtmax有升高趨勢，以大鼠造模前后(正常值-造模后值)-dp/dtmax為統計量做單因素方差分析，參附注射液組、總生物堿組、水溶性生物堿組和多糖組有一定降低-dp/dtmax的趨勢。與模型對照組比較，總生物堿高劑量在給藥后10 min時，具有顯著性差異(P<0.01)。詳細結果見表3。

表2 附子不同組分對急性心衰大鼠左心室+dp/dtmax的影響

注：與模型對照比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Composed with model group,*P<0.05,**P<0.01.

表3 附子不同組分對急性心衰大鼠左心室+dp/dtmax的影響

注：與模型對照比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Composed with model group,*P<0.05,**P<0.01.

3.4 對急性心衰大鼠神經體液因子的影響

大鼠經造模后，模型對照組Ang-Ⅰ、Ang-II、TNF-α、ANP均較空白組有所升高，其中Ang-Ⅰ、Ang-II和ANP升高明顯，具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。與模型對照組比較，參附注射液、總生物堿組、水溶性生物堿組、脂溶性生物堿組和多糖組均有一定降低Ang-Ⅰ的趨勢，其中總生物堿低劑量組和水溶性生物堿低劑量組具有顯著性差異(P<0.05)；參附注射液、總生物堿組、水溶性生物堿組有一定降低Ang-II的趨勢，其中總生物堿低劑量組和水溶性生物堿高、低劑量組具有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)；參附注射液、總生物堿組、水溶性生物堿組有一定降低TNF-α的趨勢，但無統計學差異；除脂溶性成分外，各組均有降低ANP的趨勢，且均有顯著性差異(P<0.05或P<0.01)。結果詳見表4。

表4 附子不同組分對急性心力衰竭大鼠的神經體液因子影響

注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。

Note:Composed with cotrol group,#P<0.05,##P<0.01;composed with model group,*P<0.05,**P<0.01.

4 討論

AHF是指由于急性心臟病變引起心排出量急劇降低導致的組織器官灌注不足和急性瘀血綜合征，其發生率及病死率相對較高，因此，盡可能的延緩病情發展、控制病死率成為目前研究的一大熱點。當急性心力衰竭發生時，心臟收縮和舒張功能的紊亂導致+dp/dtmax大幅下降和-dp/dtmax大幅上升，Ang-II作為RAAS系統中一類重要的活性物質，血管緊張素原可在血液循環系統中經過與腎素的作用轉化為Ang-I，之后，Ang-I則可通過血管緊張素轉化酶的作用進一步轉化為Ang-II。因心衰時RAAS系統受到激活，腎素活性升高，Ang-I的水平提高，故血液中含量顯著升高的Ang-II可刺激血管加壓素的分泌、血管的收縮、促交感神經遞質的釋放，使心臟的前后負荷加重，從而增加心肌的耗氧量。在心臟壓力負荷增加的同時，又會引起TNF-α mRNA及蛋白質的表達，進而促進TNF-α的產生和釋放，進一步誘導細胞調亡和心室重塑，惡化心力衰竭的發展，形成惡性循環[15]。心臟內分泌激素ANP在一定程度上可緩解心力衰竭引起的血容量增加、水鈉潴留，減輕心臟負荷，使心功能暫時得到改善，還可發揮局部抗纖維化的作用，但這是一種代償反應，其作用遠不敵其他細胞因子、神經內分泌激素等對心臟造成的損害，并不具備明顯的對抗心衰的作用。隨著心衰的發展和惡化，ANP的分泌量增多，其含量與心衰的嚴重程度呈正相關，心衰越嚴重則ANP含量越高，所以ANP可將視為判斷心衰等級的一個評價指標?？偠灾?，在心力衰竭心室重構過程中，神經-體液-細胞因子之間相互作用，構成一個互相調節的體系，多種環節互相影響加重疾病進程[16]。

作為臨床常見的急危重癥之一，急性心力衰竭發作迅速，且發病人群沒有顯著的性別差異，因此，本實驗研究選用雌雄各半的大鼠。經鹽酸普羅帕酮造模后，模型大鼠左心室收縮和舒張功能迅速減退，具體在血流動力學方面表現為HR、+dp/dtmax的顯著下降和-dp/dtmax的升高，血漿中神經體液因子Ang-I、Ang-II、ANP以及炎性細胞因子TNF-α含量的增加，即大鼠心臟前后負荷增加，RAAS系統興奮，炎性細胞因子出現高表達，符合心力衰竭的發病機制。課題組前期通過一系列研究，已經確定了附子對心力衰竭的治療作用，但其成分的復雜性和藥效成分的不明確性會直接影響其體內作用規律的研究和臨床用藥的開展，在此基礎上，本實驗旨在篩選附子的強心組分，探索更多附子可能的強心物質基礎，為其藥效動力學研究以及臨床應用提供參考和支持。本實驗在給予附子不同組分后，就血流動力學方面，總生物堿組和水溶性生物堿組可不同程度的升高模型大鼠各時間點的HR和+dp/dtmax，降低-dp/dtmax，改善心肌功能；在神經體液因子調節方面，總生物堿組、水溶性生物堿組、脂溶性生物堿組和多糖組均有一定降低Ang-Ⅰ、Ang-II的趨勢，阻斷RAAS系統介導的血管收縮、血壓升高，下調炎性細胞因子TNF-α的表達，最終減少心房本身合成和分泌的ANP，減輕心臟的前后負荷，改善和延緩心室重構。

從所得數據分析可看出，總生物堿高劑量組對增強HR、升高左心室+dp/dtmax和降低-dp/dtmax的作用最強，其次是水溶性生物堿低劑量，且兩者均能顯著降低血清中與心力衰竭有關的神經體液因子，有效治療急性心力衰竭，由此可見，附子水溶性生物堿以及總堿是其發揮強心作用的主要物質基礎。本研究僅在10 g生藥/kg和5 g生藥/kg兩個劑量下對附子總生物堿和水溶性生物堿進行抗急性心力衰竭大鼠的實驗研究，然而，附子的生物堿類成分對心率影響具有濃度依賴性，小劑量下能對抗心律失常，大劑量則誘發心律失常。因此，課題組接下來將會對附子不同組分對于心力衰竭的量-毒-效的作用靶點以及發生生理效應的下游機制進行深入探討，弄清附子發揮藥理作用的整個過程，并且對作用靶點、分子機制和藥理作用之間的關系做進一步驗證。