咖啡特異性實時熒光PCR檢測方法的建立

梁穎婕 冼鈺茵 劉婧文 黃成棟 奚星林 凌莉*

（1.廣東檢驗檢疫技術中心 廣東廣州 510623；2.廣東省動植物與食品進出口技術措施研究重點實驗室）

1 前言

咖啡是全球最受歡迎的食品之一，為世界三大飲料之首，是國際貿易中十分重要的原料產品，主要有阿拉比卡和羅布斯塔兩個品種[1]。在供不應求的情況下，不法商人為有利可圖而在咖啡中摻入玉米、大麥、小麥、大豆、大米等物質[2]。目前，鑒別咖啡的方法有物理法[3]、化學法[4,5]、色譜質譜法[6]、光譜法[7]和分子生物法[8]等。近年來，隨著分子生物學技術的不斷發展，基于DNA的物種鑒別方法（如PCR技術等）已發展成為分析化學技術的有效補充方法，它具有方便、準確、迅速、簡潔的特點，越來越多地應用于咖啡檢測中[9,10]。Ferreira等[11]設計了咖啡的特異性引物對，用實時熒光PCR染料法檢測咖啡成分。

實時熒光PCR探針法也是一種快速鑒別物種的方法，而迄今為止，未有相關研究使用探針法快速鑒別咖啡物種。本實驗旨在設計出咖啡的物種特異性引物與探針，建立一種快速、準確檢測咖啡成分的方法。

2 材料與方法

2.1 材料與試劑

實驗的咖啡樣品見表1，購自廣州各大超市；黃豆、黑豆、綠豆、紅豆、眉豆、花生、小米、蕎麥、小麥、玉米、蘋果、梨、橙子、紅棗、核桃、木瓜、甜菜、大米、米粉、雞、鵝、水鴨、水牛、綿羊、豬、馬、家兔、羅非魚、牡蠣、蝦均購自廣州永旺超市；SD大鼠、轉基因大豆來自本實驗室，用于咖啡的特異性檢測。

QuickGene DNA tissue kit S，日本KURABO公司；Wizard Genomic DNA Purification Kit，Promega公司；MagDEADNA200 （GC）， 日本 PSS公司；Takara Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)，寶生物工程（大連）有限公司。

2.2 主要儀器與設備

表1 實驗咖啡樣品

2.3 實驗方法

2.3.1 DNA提取與制備

將2.1提到的樣品用研磨機或攪拌機均質研磨成粉狀或肉碎狀。使用2.2中的3種DNA提取試劑盒提取咖啡樣品的基因組DNA，其余陰性對照樣品用Magtration12GC PLUS核酸提取儀搭配MagDEADNA200（GC）試劑盒提取。提取方法詳見試劑盒操作說明書。使用Nano核酸蛋白含量測定儀測定基因組DNA的濃度。用1×TE緩沖液作系列稀釋，使咖啡 DNA 濃度為 10.00 ng/μL、5.00 ng/μL、1.00 ng/μL、0.50 ng/μL、0.10 ng/μL、0.01 ng/μL。用非咖啡物種的DNA （大豆DNA）梯度稀釋咖啡DNA，得到10.00% 、1.00% 、0.10% 、0.01% 的 DNA 溶 液 。25 μL體系內加1 μL的DNA，用于進行DNA檢測靈敏度檢測。

2.3.2 引物及探針的設計與合成

本研究參考Denoeud F對咖啡基因組的分析[12]，通過在NCBI數據庫上反復尋找篩選，找到了咖啡的黃苷甲基轉移酶（Xanthosine Methyltransferase 1，XMT1）基因（Gene Bank:JX978514.1 和 JX978509.1）上的特異性片段，使用軟件Primer Express設計出引物和探針，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物為PAGE級，探針為HPLC級?？Х纫锖吞结樞蛄蟹謩e為：

2.3.3 實時熒光PCR反應

實時熒光 PCR 反應體系（25 μL）：2×PCR Premix Extaq 12.5 μL，引物（10 μmol/L）及探針（10 μmol/L）各 1μL，參比熒光 ROX（50×）0.5 μL，模板 DNA 1 μL，用 ddH2O 補足體系。擴增條件為：95℃，30s；95℃，5s；60℃，30s，共 40 個循環。

3 結果

3.1 咖啡引物與探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P的特異性驗證

按照2.3的方法，用咖啡引物與探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P擴增C1～C7編號的咖啡豆和其他非咖啡樣品，進行咖啡引物與探針的特異性驗證。實驗結果如圖1所示，本套引物與探針對7種咖啡豆的DNA均有明顯的擴增，對其他糧食作物、禽類、海鮮和哺乳類動物都無明顯擴增，說明咖啡引物與探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P具有物種特異性。

3.2 咖啡引物與探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P檢測靈敏度分析

咖啡引物與探針的檢測靈敏度，指在35個循環內對咖啡基因組DNA的檢測陽性的最低DNA量。從圖2A可知，本檢測體系對咖啡基因組DNA的檢測敏感度為0.1 ng/μL，即建立的實時熒光PCR檢測方法的定性最低檢測限為0.1 ng/μL。用初始等濃度的大豆DNA梯度稀釋咖啡DNA，進行實時熒光PCR的靈敏度檢測，結果如圖2B所示，實驗靈敏度達到0.1%（DNA濃度百分數）。

3.3 穩定性分析

圖1 咖啡引物探針XMT1-F/XMT1-R/XMT1-P實時熒光PCR特異性檢測

圖2 咖啡DNA實時熒光PCR的靈敏度檢測

選取濃度分別為 10.0 ng/μL、1.0 ng/μL、0.1 ng/μL的咖啡DNA作模板，25 μL體系內加1 μL的DNA，每個濃度做20個平行，進行穩定性實驗。結果如圖3所示，本實驗體系能穩定檢測出咖啡DNA。

3.4 市售咖啡的應用檢測

選取市售的咖啡進行實時熒光PCR反應，評價本實驗咖啡引物探針的實際應用檢測效果。實驗結果如圖4所示，本檢測體系的咖啡引物探針對來自世界各地的16種市售咖啡豆（C1～C16）均有明顯擴增。然而對速溶咖啡（C17～C20）的擴增曲線不明顯，在咖啡瓶裝飲料（C21～C24）中也未出現擴增曲線。

圖3 咖啡DNA實時熒光PCR穩定性檢測

圖4 市售咖啡豆和咖啡飲料的實時熒光PCR檢測

4 討論與分析

近年來，PCR及其衍生技術的快速發展大大推動了物種鑒定技術的快速發展。Ferreira等設計了咖啡特異性引物對，用實時熒光PCR染料法建立標準曲線，定量檢測咖啡中的摻假谷物成分。而Taqman實時熒光PCR探針法具有重復性好、特異性強、線性范圍廣的優點，在各個領域有著廣泛的應用[13]。建立探針法定性檢測咖啡成分，對日后更加準確地定量檢測咖啡摻假有重要的意義。另外，還可以為日后鑒別阿拉比卡與羅布斯塔兩個咖啡物種提供分子生物學技術支持。

咖啡的XMT1酶是咖啡物種中咖啡因生物合成途徑上的關鍵酶，也是咖啡特有的蛋白質，阿拉比卡和羅布斯塔兩種咖啡都含有此酶的基因。本實驗選取XMT1基因上的特異性片段設計了一套引物及探針，進行咖啡成分的實時熒光PCR定性檢測，結果表明，這組引物探針可以特異性的擴增咖啡，與常見豆類、谷物、蔬菜、水果以及動物均無交叉反應，具有咖啡物種特異性。在DNA百分比水平上，這組引物探針的檢測靈敏度為0.1%；在DNA質量靈敏度的測試中，檢測靈敏度為0.1 ng/μL。

在提取咖啡DNA的方法研究上，Martellossi C等[14]和Spaniolas S等[15]使用了多種DNA提取方法來獲得各種咖啡豆、咖啡粉和速溶咖啡的DNA。參照先前文獻，對于市售咖啡的檢測，本實驗同時使用了3種DNA提取試劑盒 （Kurabo、Promega和PSS）提取咖啡樣品的DNA。提取效果取決于樣品的狀態，在咖啡豆中可以提取出高質量和數量的DNA。然而在速溶咖啡和咖啡飲料中未能得到合適數量和質量的DNA，實時熒光PCR檢測結果為陰性?？赡苡捎谒偃芸Х冗€有其他含咖啡產品的咖啡含量相對較少，加之制作工藝對咖啡DNA有破壞降解作用，造成DNA提取質量和數量不理想，檢測結果不如預期。現有的提取方法不一定適合咖啡衍生產品的DNA提取，因此，日后需要對工業加工的咖啡產品DNA提取方法作進一步研究。

本研究建立的咖啡物種特異性實時熒光PCR定性檢測方法具有穩定性好、特異性強和靈敏度高的特點，通過一系列的驗證實驗，說明PCR定性檢測體系在分子水平鑒定咖啡是可行的。此方法能快速、準確對咖啡進行定性檢測，為今后利用分子生物學方法檢測咖啡摻假提供技術依據。