芽孢桿菌BU108抑制瘡痂鏈霉菌發酵條件的優化

申永瑞， 宋 燁， 向君亮， 王佳琦， 劉 權， 殷奎德

(黑龍江八一農墾大學 生命科學技術學院，黑龍江 大慶 163319)

馬鈴薯瘡痂病是馬鈴薯的常見病害，不僅嚴重影響馬鈴薯的品質，還會導致馬鈴薯產量的下降，造成經濟損失[1-2]。馬鈴薯瘡痂病是由瘡痂鏈霉菌(Streptomycesscabies)引起的一種危害馬鈴薯塊莖的病害，主要通過土壤進行病菌的傳播，從皮孔或傷口侵入后染病，其發病癥狀一般為薯塊表面產生凸起或凹陷的病斑[3]。在我國，馬鈴薯瘡痂病在甘肅、黑龍江、四川和云南等馬鈴薯產區發生十分廣泛[4-7]。由于馬鈴薯瘡痂病的發病日趨頻繁，但傳統化學防治會造成農藥殘留和環境污染，因此對馬鈴薯瘡痂病進行生物防治顯得尤為重要。

芽孢桿菌是一種理想的生防微生物，對高溫、紫外線和酸堿環境均具有一定的耐受性，能夠產生多種抗菌物質如多肽、多糖、次生代謝物、抗菌蛋白等[8-9]，對病害起到良好的防治效果。目前，已出現多種芽孢桿菌與馬鈴薯瘡痂病生物防治相關的報道[10-12]，如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)等。但是，由于菌株在施加土壤后抑菌活性的發揮受到嚴重限制，目前并未見有芽孢桿菌在田間大規模的應用。因此，如何提高芽孢桿菌的抑菌活性有待進一步研究。現階段，芽孢桿菌發酵培養條件的優化是提高芽孢桿菌抑菌活性的主要途徑。響應面法(Response Surface Methodology，RSM)是一種生物過程優化的統計學試驗設計方法，對影響生物過程的因子及其交互作用進行評價，確定最佳水平范圍[13]。此外由于其具有試驗次數少、試驗周期短、精密度高、求得回歸方程精度高、預測性能好，能研究幾種因素間交互作用等優點，目前已得到廣泛應用[14-17]。

筆者等前期分離得到一株對瘡痂鏈霉菌具有顯著拮抗作用的生防菌Bacillussp.BU108，并采用單因素多水平試驗設計方法對其碳源、氮源、碳源/氮源(質量比)、無機離子、培養時間等發酵條件進行了優化[18]。為進一步提高BU108對瘡痂鏈霉菌的抑制效果，通過Plackett-Burman試驗、Box-Benhnken試驗和響應面分析等數學統計方法對BU108的發酵培養條件進行優化，旨在確定BU108的最佳發酵培養條件，提高BU108對瘡痂鏈霉菌的抑菌活性，為馬鈴薯瘡痂病的生物防治提供材料和依據。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株為Bacillussp.BU108，病原菌為瘡痂鏈霉菌，均由筆者所在的試驗室分離保存。

瘡痂鏈霉菌培養基為YME固體培養基：麥芽糖 1%，酵母浸粉 0.4%，葡萄糖 0.4%，瓊脂 2%，pH 7.2。

Bacillussp.BU108培養基：LB培養基(基礎種子培養基)為NaCl 1%，蛋白胨 1%，酵母浸粉 0.5%，pH 7.5；初始優化培養基為葡萄糖(碳源)，酵母浸粉(氮源)，碳源/氮源(質量比)1∶2，NaCl 0.5%，KH2PO40.05%，MgSO4·7H2O 0.05%，pH 8[18]。

1.2 發酵培養條件

將Bacillussp.BU108接種在5 mL LB液體培養基中，于37℃，175 r/min過夜培養。將培養液按照1∶100比例接種在裝有300 mL發酵培養條件的500 mL錐形瓶中，于28℃，170 r/min培養22 h。采用冷凍離心法(12 000 g，離心15 min)獲得上清培養液。

1.3 抑菌活性檢測

采用牛津杯法進行抑菌活性的測定。在無菌平皿中倒入20 mL已融化的YME固體培養基，凝固后，加入150 μL病原菌懸液，使用無菌涂布器進行涂布至干燥，制成病原菌培養基。將已滅菌的牛津杯平整地擺放在培養基上，向牛津杯中加入100 μL芽孢桿菌上清液，隨后將病原菌培養基放置在28℃培養箱培養24 h，以空白發酵液培養基為對照，測量抑菌圈半徑，重復5次，計算平均值進行抑菌活性的測定。

1.4 響應面試驗

1.4.1 Plackett-Burman試驗 以抑菌圈半徑為響應變量，在單因素試驗的基礎上[18]選取氮源(酵母浸粉)、碳源(葡萄糖)、培養溫度、pH、碳源/氮源(質量比)、培養時間、無機離子(NaCl)共7個因素進行Plackett-Burman試驗。通過Minitab 15.0設計Plackett-Burman試驗方案(表1)，確定試驗次數12次，6次重復，選取1和-1水平對各因素進行編碼，然后根據Plackett-Burman試驗設計方案進行抑菌活性試驗，確定對Bacillussp.BU108抑菌效果有較大影響的因子。

1.4.2 Box-Benhnken試驗 根據Plackett-Burman 試驗結果篩選得到主要影響因子，在確定其他因素均在最優水平的基礎上，通過響應面試驗設計Box-Benhnken試驗對主要因素進行優化，建立主要影響因素與抑菌圈半徑二次多項數學模型，找出抑菌活性的最佳值。通過Design Expert 8.0設計Box-Benhnken試驗方案，并進行6次重復試驗以便于保證試驗的準確性。以Bacillussp.BU108 的抑菌圈半徑為響應值，經回歸分析后，確定函數方程式，并且根據 Box-Benhnken 試驗設計結果進行抑菌試驗，對試驗模型進行顯著性分析，進一步優化主要影響因素，確定Bacillussp.BU108發酵培養的最佳條件。

表1 Plackett-Burman試驗設計方案Table 1 Design scheme of Plackett Burman experiment

1.4.3 發酵條件驗證 利用響應面軟件(Design Expert)分析Bacillussp.BU108的最佳培養條件，將響應面優化得到的最佳培養條件與初始發酵條件進行發酵試驗，重復6次，隨后采用牛津杯法對菌株進行抑菌活性檢測，并將實際檢測得到的抑菌圈半徑與理論值進行比較，從而確定模型的有效性。

2 結果與分析

2.1 影響BU108抑菌活性的主要因子

根據Plackett-Burman試驗結果(圖1)可知，采用7號方案進行PB試驗得到的培養條件最佳，抑菌圈半徑最大(12.2 mm)，抑菌效果最顯著。通過SPSS 18.0對Plackett-Burman試驗的7個因素進行主效應分析結果(表2)表明，初始優化培養基的3個成分可信度均大于95%，P值越小，系數越顯著。以抑菌圈半徑為響應變量確定其影響因素從大到小分別為無機離子(NaCl)、培養時間、碳源/氮源(質量比)、氮源、碳源、pH、培養溫度，從而確定其主要影響因素為無機離子(NaCl)、培養時間和碳源/氮源(質量比)。

圖1 Bacillus sp.BU108菌株對瘡痂鏈霉菌的抑菌圈半徑Fig.1 Radius of inhibition zone of B. subtilis BU108 for Inhibiting S. scabies

表2 7個試驗因子的主效應Table 2 Main effect of seven testing factors

2.2 主要影響因素的優化

為了進一步優化Bacillussp.BU108的培養條件，根據Plackett-Burman 試驗結果對3個主要影響因素即無機離子(NaCl)、培養時間和碳源/氮源(質量比)進行深入優化，通過Design Expert 軟件進行Box-Behnken(響應面)設計并將每個因素以-1、0 、1 進行3個水平編碼(表3)。根據Box-Behnken試驗設計共進行17次試驗(表4)，并進行 6次重復試驗，通過牛津杯法檢測各試驗組發酵液的抑菌活性，隨后通過Design Expert軟件進行數據分析，構建得到二次響應面回歸方程:

式中，x1為碳源/氮源(質量比)，x2為培養時間，x3為無機離子(NaCl)，y為抑菌圈半徑。

表3 主因素水平設計的因子及水平Table 3 Factors and Level of main factor level design

表4 主因素正交試驗及其抑菌圈半徑Table 4 Radius of inhibition zone of main factor level design

2.3 BU108的最佳培養條件

對二次響應面回歸方程的分析結果(表5)可知，二次響應面回歸方方程的F值為5.15，且P大于F值的概率為0.021，因此得到的方程具有顯著性。進一步確定菌株BU108的最佳培養條件：碳源為葡萄糖，氮源為酵母浸粉，MgSO4·7H2O 0.05%，NaCl 0.68%，KH2PO40.05%，碳源/氮源(質量比)1∶2.46，初始 pH 8.0，培養時間為22.56 h。模型可信度分析的回歸方程相關系數R2=86.87%，說明86.87%所得的抑菌圈半徑的變化可以用此方程來解釋，方程擬合效果較好；CV值為13.59%，表明方程可信度較高，試驗操作可靠，可以用于下一步試驗。

2.4 主要影響因子的相關性

等高線的形狀越接近橢圓形，則兩因素之間的交互作用越顯著。響應面圖能夠直觀地反映兩因子交互作用對響應變量產生的影響，每個響應面分別表示2個獨立變量間存在的相互作用，同時其他變量保持在最佳水平。從圖2可知，培養基中碳源/氮源、培養時間和無機離子兩兩之間存在交互作用，其中碳源/氮源與培養時間之間的交互作用最為顯著。此外隨著對培養基中3個主要成分的優化，響應變量(抑菌圈半徑)逐漸增大，達到穩定點后，抑菌圈半徑不再變化，進一步證明了培養基中3個主要成分與Bacillussp.BU108的抑菌活性具有密切的相關性。

表5 回歸方程分析結果Table 5 Results of regression equation analysis

2.5 發酵條件的驗證

發酵條件的驗證結果表明，初始發酵條件得到的抑菌圈半徑為9.2 mm，經響應面優化后的抑菌圈半徑為12.7 mm，抑菌率提高28%；此外，優化后抑菌圈半徑的實際值與理論值(12.9 mm)相比，其相對誤差僅為0.023，進一步證明響應面法優化得到Bacillussp.BU108的發酵培養條件參數準確可靠，證實了模型的有效性。

3 結論與討論

研究在單因素試驗的基礎上，采用Plackett-Burman試驗方法，以抑菌圈半徑為響應變量，對各個因素的效應進行評價，確定3個主要的影響因素分別為碳源/氮源(質量比)、培養時間和無機離子(NaCl)，其他因素分別固定在各自的最優水平上。隨后通過Box-Benhnken試驗對 3個主要因素進一步優化，并建立二次響應面回歸模型，確定最佳培養條件。結果顯示，Bacillussp.BU108的最佳發酵培養條件為碳源/氮源1∶2.46，NaCl 0.68%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.05%，初始 pH 8，培養時間22.56 h。在優化條件下經搖瓶培養試驗驗證，理論值與驗證試驗的平均值接近，與初始培養條件相比，抑菌率提高28%，抑菌圈半徑達12.7 mm。因此，采用響應面分析法優化得到的Bacillussp.BU108的發酵條件準確可靠，具有實際應用價值。

芽孢桿菌的發酵條件優化主要采用正交試驗和響應面試驗設計等方法，盡管正交試驗能夠對菌株的培養條件進行優化，但是在試驗過程中往往需要耗費大量的時間和精力。在單因素試驗的基礎上首先采用響應面設計方法中的Plackett-Burman試驗篩選得到主要影響因素[19]，隨后通過Plackett-Burman試驗對主因素進行優化，從而得到響應方程，此方法試驗次數更少且結果更加準確，有利于確定Bacillussp.BU108的最佳發酵條件，為馬鈴薯瘡痂病的生物防治和微生物殺菌劑的開發奠定了基礎。

試驗采用響應面分析法對Bacillussp.BU108的培養條件進行優化并確定了最佳發酵條件，后期研究將在試驗的基礎上對Bacillussp.BU108抗菌物的表達量及純化工藝進行深入優化，進而提高其發酵效率和抑菌活性。研究結果為Bacillussp.BU108的工業化生產提供了重要的參考價值。