隴西臘肉加工過程中優勢乳酸菌的分離及其發酵性能研究

鄧展瑞, 贠建民, 郭 娟, 牛耀星, 李彥虎

甘肅農業大學食品科學與工程學院, 蘭州 730070

臘肉是一種中國特色傳統發酵肉制品，具有色澤鮮美、風味濃厚、食用方便、便于貯藏等特點[1]。傳統的臘肉制品是以新鮮的畜禽肉為原料，添加一定的輔料，經過腌制、風干等多道工序加工而成[2]，我國臘肉按地區可分為四川臘肉、甘肅隴西臘肉、湖南臘肉、廣東臘肉等[3]。隴西臘肉是以五花肉為原料，添加食鹽、八角、花椒等十多種輔料，以傳統的生產加工方式腌制而成[4]。

長期以來，臘肉制品多通過手工作坊生產，多種微生物自然發酵產生的獨特風味物質賦予了其良好的口感[5]。但由于在臘肉生產加工過程中缺乏對微生物的有效控制，臘肉在貨架期易發生微生物性腐敗等不同程度的質量問題[6]，而且傳統發酵肉制品工業化生產及工藝現代化改造等方面的研究起步較晚，這種狀況制約了傳統肉制品加工產業的持續發展。

本研究以隴西臘肉為分離材料，通過經典形態學分類和生理生化鑒定，分析隴西臘肉中的優勢乳酸菌；并通過測定優勢乳酸菌菌株的產酸能力、生長特性、耐氯化鈉和亞硝酸鈉能力以及產氣、產黏液、產蛋白酶和脂肪酶的能力等，篩選出具有優良發酵性能的菌株；隨后開展人工接種優良菌株的臘肉模擬加工試驗，分析其對臘肉感官品質的影響，以期篩選出可用于隴西臘肉加工的發酵性能優良的乳酸菌，為隴西臘肉發酵劑的研制及其向工藝現代化改造發展提供一定的依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗所用隴西臘肉為甘肅省隴西縣大胡子臘肉。采樣階段：原料肉、腌制中期(1～25 d，于第23 d采樣)、腌制后期(26～45 d，于第45 d采樣)、風干中期(46～90 d，于第70 d采樣)、成品肉。每個采樣時間點3次重復。

1.2 儀器與設備

LDZX-50KBS型立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫療器械廠)；超凈工作臺(蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司)；XSP-SM02型顯微鏡(重慶光學儀器廠)；pHS-3C型pH計(上海雷諾儀器廠)；FA1204B型電子天平和722S型可見分光光度計均購自上海佑科儀器儀表有限公司；電熱鼓風干燥箱和電熱恒溫培養箱均購自上海精宏儀器設備有限公司。

1.3 微生物計數

1.3.1取樣 ①表面取樣。隴西臘肉的表面取樣參照GB 4789.17-2003[14]，采用棉拭取樣法。首先，制作1個5 cm2(2.5 cm×2 cm)的取樣器，于無菌條件下，在隴西臘肉的表面確定10個點。然后，將5 cm2的取樣器依次壓在隴西臘肉表面已確定的10個點上，將滅菌棉簽稍沾濕，于取樣器5 cm2的范圍內揩抹多次，隨后立即剪斷，投入裝有50 mL滅菌水的錐形瓶中。10個棉簽完全浸在錐形瓶的無菌水中，將錐形瓶放置在搖床培養箱中，于30℃、160 r/min的條件下振蕩培養30 min，然后取瓶中的液體作為基礎液，再按要求作10倍遞增稀釋。

②內部取樣。隴西臘肉的內部面取樣參照GB 4789.17-2003[14]。將內部面進行表面灼燒消毒，再用無菌剪刀剪取隴西臘肉內部深層肌肉25 g，放入滅菌乳缽內，用滅菌剪刀剪碎后，加入滅菌海沙，磨碎后加入滅菌水225 mL，混勻，即為10-1稀釋液。

1.3.2乳酸菌計數 乳酸菌計數方法參照GB 4789.2-2016[15]。乳酸菌計數通常選用菌落個數在30～300之間的平板進行。

1.4 優勢乳酸菌的鑒定

1.4.1優勢乳酸菌的菌落觀察 選取適宜濃度的隴西臘肉不同加工階段的微生物稀釋液涂布在MRS培養基上，培養48 h后，對平板上菌落形態不同且數量多的單菌落進行純化；再以革蘭氏染色為陽性、在含有2% CaCO3的MRS培養基上37℃培養24 h后出現溶鈣圈為標準，篩選符合條件的菌株，并進行單菌落形態觀察和菌落特征描述。

1.4.2優勢乳酸菌的細胞形態觀察 根據《微生物學實驗手冊》[16]的方法，挑取MRS固體培養基上的優勢乳酸菌株菌落進行革蘭氏染色，在光學顯微鏡(目鏡10×，物鏡100×)下觀察菌株的細胞形態。

1.4.3優勢乳酸菌的生理生化鑒定 以《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[17]和《常見細菌系統鑒定手冊》[18]為參考依據，將初篩得到的菌株通過石蕊牛奶分解、V-P產生、接觸酶檢測、革蘭氏染色、七葉靈水解、糖發酵實驗、硝酸鹽還原、氧化酶檢測、明膠水解、運動性檢測、葡萄糖產酸產氣等實驗進行進一步鑒定。

1.5 發酵性能優良的菌株篩選

1.5.124 h產酸能力測定 通過活化篩選出的優勢乳酸菌菌株得到種子液，將種子液按照1%比例接種在150 mL MRS液體培養基中，于37℃培養24 h，每4 h吸取5 mL發酵液，用pH計測定相應的pH。

1.5.2生長曲線的測定 參照潘曉倩等[19]的方法。通過活化篩選出的優勢乳酸菌菌株得到種子液，將種子液按照1%比例接種在150 mL MRS液體培養基中，于37℃培養24 h，每2 h吸取10 mL發酵液，以未接種的MRS培養基做空白對照，測量每株菌株發酵液的OD600，以培養時間為橫坐標、OD600為縱坐標繪制其生長曲線。

1.5.3耐受能力測定 參照胡美忠等[20]的方法測定菌株對6.5%氯化鈉和150 mg/L亞硝酸鈉的耐受能力。通過活化篩選出的優勢乳酸菌菌株得到種子液，將種子液按照1%比例分別接種在添加了6.5% NaCl和150 mg/L NaNO2的100 mL MRS液體培養基中，于37℃靜置培養24 h后，以空白MRS培養基為對照，分別測定各菌株菌液的OD600。

1.5.4產黏液能力測試 參照胡美忠等[20]的方法。將篩選得到的優勢乳酸菌菌株接種于MRS固體培養基(其中以蔗糖代替葡萄糖)上，30℃培養24 h，用接種針挑取菌落直接觀察是否出現黏液。

1.5.5產氣能力測試 參照胡美忠等[20]的方法。將篩選得到的優勢乳酸菌菌株穿刺接種到含0.8%瓊脂的MRS培養基試管中，再向試管中傾倒2 cm 2%瓊脂封口，37℃培養48 h，觀察試管產生氣泡情況，若試管內出現氣泡或者頂起2%的瓊脂，說明產氣。

1.5.6產酶能力測定 利用瓊脂板法測定菌株產蛋白酶能力[21]。將篩選得到的乳酸菌接種在添加了10%脫脂牛奶的MRS培養基中，37℃靜置培養72 h后觀察菌落周圍是否出現蛋白水解圈。參照胡珺等[22]的方法測定菌株產脂肪酶能力。將篩選得到的優勢乳酸菌菌株劃線培養于MRS培養基，37℃靜置培養48 h后進行活化，將活化后的菌落轉接種于添加了1%三丁酸甘油酯的MRS培養基，37℃靜置培養72 h后觀察菌落周圍是否出現脂肪水解圈。

1.6 乳酸菌優良菌株的分子生物學鑒定

提取篩選出的優良菌株的總DNA，16S rDNA擴增和測序由北京天一輝遠生物科技有限公司完成，將測序所得的16S rDNA序列校對后，利用NCBI的GenBank(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)數據庫進行BLAST分析，根據序列同源性，確定菌株的種屬關系。采用MEGA 7.0建立菌株的系統發育樹。

1.7 接種乳酸菌優良菌株的模擬臘肉發酵試驗

將新鮮菌液按2%的接種量轉接至MRS肉湯培養基中，37℃培養18～24 h，于4℃ 5 000 r/min離心15 min后收集沉淀，用無菌生理鹽水洗滌，再次離心收集沉淀，隨后加入無菌生理鹽水將菌體懸浮，制備107CFU/g菌懸液，4℃保存備用。

在甘肅省隴西縣大胡子臘肉生產基地，在傳統的隴西臘肉制作工藝方法和配料的基礎上，對原料肉進行乳酸菌優良菌株的噴涂接種，接種量為1 mL/kg。原料肉大小為40 cm×15 cm，約4 kg。55 d后獲得成品肉。同時，以未進行接種的臘肉作為對照組。

1.8 成品肉感官評價

選擇15位專業人員組成感官評定小組，將接種和未接種的臘肉分別在高壓鍋內蒸30 min，蒸熟后切成厚度為4～5 mm的切片，分別對2種產品的氣味、滋味、色澤、口感和組織結構5項指標進行評定(表1)，確定產品整體可接受性。根據臘肉產品的感官要求，設定各指標的權重為氣味0.3、滋味0.3、色澤0.2、口感0.1、組織結構0.1。

表1 感官評價評分標準Table 1 Standard of sensory evaluation.

1.9 數據分析

所有數據均為3次重復試驗所得，然后利用SPSS 20進行顯著性分析、Excel 2010計算平均值和標準誤差、Origin 8.0繪圖。

2 結果與分析

2.1 隴西臘肉加工過程中乳酸菌數量動態變化

為了更好地控制隴西臘肉加工過程中的有益菌群，保證產品品質，首先對隴西臘肉加工過程中乳酸菌數量的動態變化進行了分析。圖1反映了隴西臘肉加工過程不同階段表面和內部乳酸菌數的變化規律。從原料肉到成品肉，隴西臘肉表面和內部的乳酸菌數均呈先升高后降低趨勢。每個階段中表面乳酸菌數都比內部乳酸菌數多，但腌制中后期表面乳酸菌數比內部乳酸菌數增長速度慢，從腌制中期到腌制后期，表面和內部的乳酸菌數分別增長了7.22倍和38.11倍；到風干中期，隴西臘肉表面和內部的乳酸菌數達到峰值，分別為3.62×107CFU/g和2.77×106CFU/g，表面乳酸菌數比內部乳酸菌數高出3.34×107CFU/g；之后隨著加工過程的進行，乳酸菌數逐漸下降。

從原料肉到腌制后期，由于肉塊基質中含有豐富的營養物質，且pH、水分活度適宜，有利于乳酸菌的生長，因而引起表面和內部的乳酸菌數持續增加；到了風干中期，因為肉塊要懸于晾曬架上進行晾曬，肉塊開始與空氣接觸，來自環境的乳酸菌又附著在肉塊表面并開始生長繁殖，且這個階段肉塊基質中水分含量和營養物質也滿足乳酸菌生長需要，因此，表面和內部的乳酸菌數仍在逐漸增加。但是隨著風干的進行，肉塊基質中的水分含量迅速下降，同時因微生物的生長消耗，基質中還原糖含量逐漸減少，不適宜乳酸菌生長，從而使隴西臘肉表面和內部的乳酸菌數呈下降趨勢。

從乳酸菌數在肉塊基質的分布來看，內部乳酸菌數量明顯低于表面，這可能是由于內部乳酸菌主要是從表面侵入肉塊的。而在腌制中后期，表面乳酸菌數量比內部乳酸菌增長速度緩慢，這是由于在腌制過程中，大量食鹽和辛香料的添加，致使肉塊表面滲透壓迅速增加，并隨食鹽和辛香料從肉塊表面慢慢滲入內部。由于表面食鹽濃度高于內部，所以肉塊基質表面的水分活度低于內部的水分活度，不利于乳酸菌等微生物的生長，從而導致內部乳酸菌增長速度比表面的快。

圖1 隴西臘肉加工過程乳酸菌數的變化趨勢Fig.1 Changing trend of LAB number during the processing of Longxi bacon.

2.2 優勢乳酸菌分離鑒定

選取適宜濃度的隴西臘肉不同加工階段的微生物稀釋液涂布在MRS培養基上培養48 h，隨后在平板上挑取菌落形態不同且數量多的單菌落，利用平板劃線法，將分離到的菌株在MRS培養基上進行純化，共得到38株乳酸菌。經革蘭氏染色試驗以及在含有2% CaCO3的MRS培養基上培養，進一步篩選獲得7株符合條件的菌株，即革蘭氏染色為陽性、有溶鈣圈且溶鈣圈與菌落直徑之比大的菌株[23]。將初篩得到的7株菌株分別編號為R-1、R-2、R-3、R-4、R-5、R-6和R-7(圖2)。其中，腌制中期分離出的菌株為R-2和R-6；腌制后期分離出的菌株為R-3；風干中期分離出的菌株為R-1、R-4和R-7；成品肉分離出的菌株為R-5。

以《乳酸細菌分類鑒定及實驗方法》[17]和《常見細菌系統鑒定手冊》[18]為參考依據，對篩選出的7株優勢菌進行形態學分類和生理生化鑒定。由表2和表3可知，R-1為植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)，R-2為米酒乳桿菌(L.sake)，R-3為乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)，R-4為戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)，R-5為腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)，R-6為食品乳桿菌(L.alimentarius)和R-7為彎曲乳桿菌(L.curvatus)。

圖2 乳酸菌菌株的溶鈣圈大小Fig.2 Sizes of dissolved calcium circle of LAB strains.

表2 乳酸菌菌株的形態特征Table 2 Morphological characteristics of LAB.

2.3 發酵性能優良的乳酸菌篩選

2.3.124 h產酸能力測定 乳酸菌的24 h產酸能力是衡量菌株品質優劣的一個重要指標[24]。圖3揭示了乳酸菌在發酵過程中pH的變化規律。隨著時間的延長，培養基的pH不斷降低，所有菌株培養基pH由最初的6.78左右下降到了4.27以下。其中R-1和R-4下降幅度最大，在培養24 h后pH分別為3.30和3.47。菌株在生長過程中的前12 h，pH迅速下降，主要與培養初期乳酸的形成有關，12 h后，菌株產酸能力減弱，pH的下降速度開始減慢。

2.3.2生長曲線測定 在臘肉制品加工過程中，乳酸菌的生長情況也起著非常重要的作用。乳酸菌可通過產生酸性物質抑制某些不耐酸的有害菌生長，從而抑制腐敗菌和致病菌對臘肉制品的危害[25,26]。將7株菌株的種子液接種于MRS液體培養基中，菌株的生長曲線如圖4所示，0～2 h為菌株的延遲期，時間較短；2 h到10～12 h為對數期；10～12 h到24 h為穩定期?？梢?株菌株的延遲期較短，穩定期時間較長。其中R-1和R-4對數期增長速度最快，R-1的OD600由0.143增長到2.027，R-4的OD600由0.111增長到1.705。7株菌株的生長速度由快到慢分別是R-1>R-4>R-2>R-6>R-7>R-5>R-3，其中R-1生長速度最快。

表3 乳酸菌菌株的生理生化特性Table 3 Physiological and biochemical characteristics of LAB.

圖3 乳酸菌的產酸能力Fig.3 Acid-producing capacity of LAB.

2.3.3耐受能力測定 對NaCl的耐受能力是選擇發酵肉制品發酵劑的一個重要因素，實際生產要求菌株至少耐受6% NaCl[27]。從圖5可以看出，添加6% NaCl后7株菌株的生長均受到了不同程度的抑制。其中R-1受抑制程度最小(P<0.05)，添加NaCl后OD600由1.989下降至1.887，抑制程度為5.09%；R-2受抑制程度最大(P<0.01)，添加NaCl后OD600由1.342下降至0.737，抑制程度為45.10%；R-3、R-4、R-5、R-6、R-7受抑制程度分別為17.33%、14.11%、22.57%、16.39%、18.34%。

圖4 乳酸菌的生長曲線Fig.4 Growth curve of LAB.

GB 2762-2017規定亞硝酸鈉在肉制品中的最大使用量是150 mg/kg[28]，GB 2760-2014規定亞硝酸鈉在肉制品中的最大殘留量不超過30 mg/kg[29]。如圖5所示，當NaNO2濃度為150 mg/kg時，7株菌株生長均受到不同程度抑制，其中R-1受抑制程度最小(P<0.05)，添加NaNO2后OD600由1.989下降至1.763，抑制程度為11.37%；R-5受抑制程度最大(P<0.01)，添加NaNO2后OD600由1.103下降至0.750，抑制程度為30.12%；R-2、R-3、R-4、R-6、R-7的抑制程度分別為23.33%、15.50%、23.97%、25.33%、14.94%。

圖5 乳酸菌耐氯化鈉和亞硝酸鈉的能力Fig.5 Tolerance to sodium choride and sodium nitrite of LAB.

2.3.4產氣、產黏液及產酶能力測定 在臘肉加工過程中，一些乳酸菌經異型乳酸發酵會產生醋酸和CO2，影響產品的風味品質、組織結構[30]；而乳酸菌發酵產生的黏液會影響肉制品的顏色、質地甚至口味[31]。同時，肉制品在發酵過程中，在其內源蛋白酶的作用下，將蛋白質降解為氨基酸或多肽等，對于發酵肉制品良好風味的形成至關重要。因此，肉制品發酵所使用的微生物發酵劑不應具有較強的分解蛋白質的能力[32]。另外，微生物發酵劑也不應具有降解脂肪的能力，否則會將脂肪降解為游離脂肪酸，進而形成碳基化合物等小分子物質，導致發酵肉制品酸敗[33]。

7株菌株的基本發酵特性結果如表4所示?？芍?，只有R-5產黏液；只有R-5和R-6發酵葡萄糖產氣，其他菌株均不產氣；所有菌株均對蛋白質和脂肪無分解作用。

表4 優勢乳酸菌發酵性能Table 4 The fermentation performance of LAB.

注：+為陽性反應；-為陰性反應。

綜上所述，結合菌株的產酸能力、生長能力和耐受能力，在所有菌株中，R-1產酸能力強、生長速度更快，對食鹽和亞硝酸鈉均具有較好的耐受性。所以在7株菌株中，R-1更適合作為隴西臘肉加工過程中的乳酸菌發酵劑。

2.4 乳酸菌R-1的分子生物學鑒定

菌株R-1的PCR產物凝膠電泳分析結果如圖6所示，得到1條約1 500 bp的DNA片段，符合細菌16S rRNA序列長度，測序比對后發現，菌株R-1的16S rRNA序列與GenBank中LactobacillusplantarumLP2(登錄號為CP020816.1)的序列同源性達到98%。因此，菌株R-1的16S rRNA分子生物學鑒定結果為植物乳桿菌(L.plantarum)，這與R-1生理生化鑒定結果一致。

圖6 菌株R-1的16S rRNA基因PCR擴增結果Fig.6 PCR-amplified results of 16S rRNA gene from R-1.

2.5 人工接種乳酸菌R-1的模擬臘肉發酵試驗

在傳統的隴西臘肉制作工藝的基礎上，對原料肉進行乳酸菌R-1的人工噴涂，獲得成品肉后，由專業人員進行感官評定。由圖8可知，接種菌株R-1后，與對照組相比，接種菌株的成品臘肉除口感和色澤外，其他感官品質指標如氣味、滋味、組織結構和整體可接受性均顯著高于未接種菌株的臘肉(P<0.05)。接種菌株的臘肉在保持了隴西臘肉原有的風味、酸味純正等優良品質的基礎上，有效降低了因脂肪降解為游離脂肪酸而造成的產品酸敗的發生，同時改善了傳統臘肉制作工藝下某些乳酸菌通過異型乳酸發酵產氣造成的臘肉結構松散的問題，證明接種菌株R-1可使隴西臘肉的品質得到提升。

圖7 菌株R-1的系統發育樹Fig.7 Phylogenetic tree of strain R-1.

圖8 隴西臘肉模擬臘肉發酵試驗感官評價結果Fig.8 Sensory evaluation results of the simulated Longxi bacon fermentation test.

3 討論

乳酸菌是傳統發酵肉制品中重要的優勢菌群，在自然發酵過程中占重要地位，與產品的品質有著密切的關聯。如白琴琴等[34]從3種不同發酵肉制品中篩選出的優勢乳酸菌為乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和發酵乳桿菌(L.fermentum)。而從臘魚和臘腸中篩選出的具有潛在應用價值的乳酸菌分別為米酒乳桿菌(L.sake)、植物乳桿菌(L.plantarum)、干酪乳桿菌(L.casei)及鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)[35]。本研究從隴西臘肉中分離出了7株優勢乳酸菌菌株，結合形態學特征和生理生化特性分別鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)、米酒乳桿菌(L.sake)、乳酸乳球菌(Lactococcuslactis)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、食品乳桿菌(L.alimentarius)和彎曲乳桿菌(L.curvatus)。

肉制品的發酵一般采用2種方式：一種是自然發酵，另一種是人工輔助接種發酵。目前，隴西臘肉采用在自然條件下發酵，這種粗放式的生產工藝使得隴西臘肉存在生產周期過長、品質不可控等問題。篩選發酵性能優良的乳酸菌作為隴西臘肉的輔助發酵劑菌株，可為產品風味的改善和臘肉安全性的提高奠定基礎。因此，從隴西臘肉中分離出的7株優勢乳酸菌菌株經一系列發酵性能測試，篩選得到1株發酵性能優良，經鑒定為植物乳桿菌(L.plantarum)。該菌株生長性能良好，產酸能力強，在6% NaCl和150 mg/kg NaNO2環境下均具有較好的耐受性，不產氣、不產黏液，對蛋白質、脂肪均無分解作用，這些特性均有利于改善發酵肉制品的品質。這與劉有晴等[36]對四川臘肉中乳酸菌的篩選、產酸特性分析結果一致。而且，在隴西臘肉加工過程中接種植物乳桿菌(L.plantarum)R-1的試驗結果也證實了其能夠改善產品風味，使成品表現出更好的感官可接受性。因此，菌株R-1具有可開發為隴西臘肉輔助發酵菌劑的潛質，可為隴西臘肉乃至傳統腌臘肉制品發酵劑的研制提供一定的理論依據。但關于該菌株在其他傳統腌臘肉制品中的應用及與其他菌種結合開發復配發酵劑，還有待于進一步研究。