中華根瘤菌NP1中反硝化基因啟動子分析及熒光定量PCR驗證

張 宇, 王 森, 陳度宇, 許 雷

中國農業科學院研究生院, 北京 100081

好氧反硝化菌是一類在有氧條件下能夠進行脫氮反應的異養微生物，自Robertson和Kuene[1]在20世紀80年代發現了好氧反硝化菌Thiosphaerapantotropha、Pseudomonassp.和Alcaligenesfaecalis等之后，此類脫氮菌被陸續報道。迄今為止，已從各種環境中篩選得到許多不同種屬的具有好氧反硝化功能的菌株，如在廢水處理系統中分離獲得施氏假單胞菌PseudomonasstutzeriSU2[2]、在稻田沉積物中分離獲得反硝化產堿菌AlcaligenesdenitrificansT25[3]以及在糞便處理系統中分離獲得枯草芽胞桿菌Bacillussubtilis[4]等。

在好氧條件下，反硝化作用主要涉及4個關鍵酶, 分別是周質硝酸鹽還原酶NAP、亞硝酸鹽還原酶NIR、一氧化氮還原酶NOR和氧化亞氮還原酶NOS。周質硝酸鹽還原酶NAP在好氧時表達占主導，能將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽還原酶再將亞硝酸鹽轉化為NO氣體，一氧化氮還原酶對NO具有較高的親和力，能夠將NO還原為N2O，最后氧化亞氮還原酶能將NO、N2O兩種氣體同時還原為N2。

目前，好氧反硝化菌廣泛應用于廢水生物處理池作用于廢水生物脫氮[5]，使硝化與反硝化在同一個反應器中進行，進而大量減少了占地面積，降低成本。然而，大氣中的N2O濃度持續上升，其中很大一部分來自微生物。目前對于N2O生成的機理及原因的認識還不夠全面。一種觀點認為氧氣濃度會影響N2O還原酶的活性，低溶解氧條件下N2O會取代N2成為反硝化的最終產物[6]。還有觀點認為C/N、DO濃度、SRT(污泥停留時間) 都會影響N2O的累積，導致釋放量增加[7]。

按照控制轉錄水平的高低，啟動子可以分為強啟動子和弱啟動子。啟動子在轉錄水平上起到重要作用，不僅決定了基因的表達水平，而且決定了基因表達的時空順序[8～10]，啟動子作為指導基因起始轉錄的重要順式元件，在很大程度上決定了基因的轉錄速率，從而影響基因的表達效率[11,12]。

本文對中華根瘤菌NP1中反硝化關鍵酶基因的啟動子進行生物信息學分析，初步預測了反硝化基因啟動子的強弱，進一步利用熒光定量PCR對中華根瘤菌NP1反硝化基因的相對轉錄水平差異進行比較，最后通過直接測量反硝化過程中相關代謝產物的含量進行驗證，從而為揭示反硝化過程中N2O的釋放提供了一種合理解釋。

1 材料與方法

1.1 啟動子序列分析

從中華根瘤菌NP1的全序列中獲得周質硝酸鹽還原酶NAP、亞硝酸鹽還原酶NIR、一氧化氮還原酶NOR和氧化亞氮還原酶NOS基因的轉錄起始位點上游3 000 bp至轉錄起始位點下游的+1 000 bp序列，共計4 000 bp的這段序列包含潛在的基因啟動子序列。綜合利用BPROM(http://www.softberry.com/berry.phtml)、Tfsitescan(http://www.ifti.org/cgi-bin/ifti/Tfsitescan.pl)、NNPP(Neural Network Promoter Prediction，http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)等啟動子預測網站，通過在線分析得到預測的nap、nir、nor和nos4個基因的啟動子序列位置及相關轉錄因子序列。

1.2 供試菌株

Sinorhizobiumsp. NP1為本實驗室保存。

1.3 培養基

反硝化培養基：KNO30.72 g/L，琥珀酸鈉2.17 g/L，維氏鹽溶液50 mL/L，pH 7.0～7.5。

維氏鹽溶液：K2HPO45 g/L，NaCl 2.5 g/L，MgSO42.5 g/L，FeSO40.05 g/L，MnSO40.05 g/L。

1.4 試劑

細菌RNA小提試劑盒購自OMEGA公司、SYBR?Premix ExTaqTM(Perfect Realtime)和PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time) 均購自TaKaRa公司。引物合成為上海生工生物技術有限公司完成。Realtime-PCR反應八連管及管蓋購自美國Axygen公司。

1.5 生長曲線的測定

將單菌落接種于20 mL以KNO3為單一氮源的反硝化培養基中，每隔3 h取樣，使用分光光度計測定OD600值，繪制36 h內NP1的生長曲線。

1.6 總RNA的提取及cDNA的合成

將NP1單菌落接種于20 mL反硝化培養基中，30℃ 180 r/min震蕩培養至OD600約為1.5 h，按1%的接種量接種于新的20 mL反硝化培養基中，培養20 h和30 h后分別取1 mL菌液10 000 r/min離心2 min收集菌體，使用RNA提取試劑盒提取RNA，提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。使用RNA反轉錄試劑盒將提取的RNA反轉錄合成cDNA。

1.7 熒光定量PCR反應檢測

根據NP1菌株的4個反硝化基因序列設計其Realtime-PCR特異引物，包括周質硝酸鹽還原酶基因nap(登錄號：KR902902)、亞硝酸鹽還原酶基因nir(登錄號：FJ598613)、一氧化氮還原酶基因nor(登錄號：KR902903)、氧化亞氮還原酶基因nos(登錄號：KR080373)，采用16S rRNA為內標基因，所用引物見表1。

熒光定量PCR的反應混合液(25 μL)：12.5 μL SYBR?Premix ExTaqⅡ染料，1μL引物F，1μL引物R，2μL模板cDNA和8.5μL雙蒸水。 PCR 循環條件為：95℃預變性2 min；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40個循環。

為減少實驗差異，內標基因與目的基因每個樣品分別設3個平行重復，試驗結果取平均值。采用相對定量方法[13]表示各目的基因nap、nir、nor、nos的表達量。計算ΔCt=Ct目的基因-Ct內參基因和ΔΔCt=ΔCt待測組-ΔCt對照組，2-ΔΔCt即表示目的基因相對于對照基因的表達倍數[14]。測定以KNO3為單一氮源培養20 h和30 h后的NP1菌樣中相關反硝化基因轉錄水平的相對量進行驗證，其中每個樣品相關基因轉錄水平的變化以20 hnor基因的轉錄水平作為對照來表示。

1.10 N2O氣體含量的測定

N2O氣體含量測定采用氣相色譜法[18]。將1 mL菌液接種于含有100 mL反硝化培養基的250 mL錐形瓶中，瓶口用滅過菌的橡膠塞塞緊，保持裝置氣密性良好，搖床30℃ 180 r/min震蕩培養，一段時間后采用5 mL注射器抽取錐形瓶內的氣體注入氣相色譜儀的進樣口。N2O的測定采用氣相色譜儀(Agilent 7890)，進樣口溫度120℃，檢測器溫度280℃，以純度為99.99%，流速為30 mL/min的高純氮氣作為載氣，保留時間2 min[19]。

表1 熒光定量PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for real-time PCR.

2 結果與分析

2.1 中華根瘤菌NP1反硝化基因啟動子分析

BPROM細菌啟動子預測程序能夠預測由Sigma70啟動子調控的細菌基因的潛在轉錄起始位置，啟動子識別的準確性約為80%，同時預測到-10區和-35區啟動子核心序列相應的間隔堿基數分布信息，并給出了對應的線性判別函數(linear discriminant function,LDF)預測得分。

中華根瘤菌NP1反硝化基因的啟動子區預測結果見圖1。結果表明，硝酸鹽還原酶基因、亞硝酸鹽還原酶基因、一氧化氮還原酶基因和氧化亞氮還原酶基因分別使用各自的啟動子，即4個反硝化基因并不位于同一個操縱子，而是分別行使功能。涉及的每個啟動子的強度如表2所示，可以看出，nap和nir基因的啟動子強度相對更高，據此猜測，周質硝酸鹽還原酶和亞硝酸鹽還原酶的表達量要高于一氧化氮還原酶和氧化亞氮還原酶，并在后續實驗中進行驗證。

圖1 Sinorhizobium sp. NP1反硝化基因啟動子預測圖示Fig.1 The predicted promoters annotation of Sinorhizobium sp. NP1 denitrifying genes.

基因-35區-10 區啟動子效率napTCGTCACCGTATAAT83%nirTTGAAACTTTATAAT91%norTTGTCGGGCTGTCAT66%nosTTCTCGCGCTCTACT58%

2.2 菌株NP1生長曲線

通過1.5中的方法測定菌株NP1的生長曲線，結果如圖2所示，菌株NP1在反硝化液體培養基中生長較為緩慢，12 h后進入對數生長期，對數生長期持續時間較長， 24 h后進入平臺生長期，達到最大OD600值約1.5。

2.3 熒光定量PCR檢測反硝化基因的表達差異

通過1.6中的方法，提取NP1菌株的總RNA，結果如圖3所示。對提取出的總RNA進行反轉錄， 用1.7中的方法對反轉錄得到的cDNA進行熒光定量PCR。

圖2 菌株NP1生長曲線Fig.2 The growth curve of stain NP1.

圖3 RNA提取電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of RNA extraction.

通過熒光定量PCR技術，采用相對定量方法分析中華根瘤菌NP1的4個反硝化基因nap、nir、nor、nos在不同時期表達水平的差異，每個基因的擴增曲線均為典型的S型曲線，溶解曲線主峰單一且無雜峰，排除了非特異性擴增，經2-△△Ct法對目的基因做相對定量分析后結果如圖4所示。可以從中看出，在以KNO3為單一氮源的培養條件下，無論在20 h對數期還是在30 h平臺期，4個反硝化關鍵基因的表達并不同步。周質硝酸鹽還原酶基因和亞硝酸鹽還原酶基因的轉錄水平明顯高于一氧化氮還原酶基因和氧化亞氮還原酶基因，前者比后者的表達量高出將近一倍，這將導致氧化亞氮還原酶無法將全部NO和N2O還原為N2，造成N2O氣體的殘留并釋放到大氣中污染環境。

圖4 NP1菌株不同時期反硝化基因的表達差異Fig.4 Expression differences of denitrifying genes in different stages of NP1.

2.4 NP1菌株反硝化代謝產物分析

以KNO3為單一氮源培養NP1菌株，對其反硝化產物進行測定，結果如圖5所示，從圖5中可以看出反硝化過程主要發生在生長旺盛的5～15 h，曲線較陡表示硝態氮濃度有明顯變化，在前20 h硝態氮濃度隨著時間增加而減少，之后趨于穩定，硝態氮濃度在30 h內從初始200.00 mg/L下降到97.31 mg/L，下降很快，證明NP1菌株中周質硝酸鹽還原酶活性較高。

圖5 以KNO3為單一氮源培養NP1菌株時硝態氮消耗情況Fig.5 Nitrate consumption in NP1 cultured with KNO3 as a single nitrogen source.

如圖6所示，亞硝態氮隨著硝態氮的減少而逐步積累，當硝態氮反應完全時，亞硝態氮在15 h達到最大積累量僅為0.305 mg/L，之后緩慢下降，亞硝態氮積累逐步降低。亞硝態氮產生量極低說明亞硝酸鹽還原酶活性很高，并未造成亞硝態氮的大量積累。

圖6 以KNO3為單一氮源培養NP1菌株時亞硝態氮的積累情況Fig.6 Nitrite accumulation in NP1 cultured with KNO3 as a single nitrogen source.

由圖7可知，NP1菌株反硝化過程中N2O的產生量隨著時間延長而快速增加，最大積累量達到274 μg/m3，之后達到平穩。說明NO還原酶的活性較低，使得還原產物N2O氣體產生積累，相當一部分N2O沒能反應完全至生成N2。

圖7 以KNO3為單一氮源培養N2O菌株時硝態氮的積累情況Fig.7 N2O accumulation in NP1 cultured with KNO3 as a single nitrogen source.

3 討論

從圖1可以看出在NP1菌株中反硝化基因使用的不是同一個啟動子，這與傳統理論中認為細菌的4個反硝化基因由同一個啟動子調控不同，表2的啟動子強度分析表明在nap和nir基因發揮功能后，由于nor和nos基因的啟動子強度較弱，導致N2O和NO氣體在還原為N2前被釋放。這一發現解釋了NO2和NO氣體的釋放機理，進而為解決這一環境問題提供了理論依據。

通過熒光定量PCR對中華根瘤菌NP1的反硝化相關基因轉錄水平的差異進行了比較，結果證明在NP1反硝化過程中，一氧化氮還原酶基因和氧化亞氮還原酶基因的表達量低于周質硝酸鹽還原酶基因和亞硝酸鹽還原酶基因，進而在分子水平驗證了反硝化基因的不同步表達，也證明了上述對于反硝化基因啟動子強度的預測合理。同時對反硝化中間代謝產物含量的測定也表明，以KNO3為單一氮源培養NP1時，確實有一定量的N2O氣體釋放，推測是由于氧化亞氮還原酶基因的啟動子較弱，致使其表達量降低，無法將產生的全部N2O還原，使其釋放到空氣中造成污染。

1992年，Khalil等[20]對N2O的全球產生源估測研究中表明每年污水處理過程中釋放約0.3～3.0 Tg，占N2O總釋放量的2.5%～25%。2009年，Kampschreur等[21]研究實驗室規模的脫氮過程發現最高有近90%的氮轉化為N2O釋放，研究實際規模的污水脫氮過程發現最高近14.6%的氮轉化為N2O。Tsuneda等[22]研究實驗室規模的利用硝化活性污泥處理人工污水時發現N2O的釋放量占總氮的0.7%～13%。

調查表明N2O的溫室效應約是CO2的300倍[21]，N2O的釋放量正在以每年3%的速度持續上升，對于全球溫室效應的貢獻率已達5%～6%[23]。N2O的大量釋放會引起酸雨，破壞臭氧層[24]。因此，在利用微生物進行污水處理的過程中N2O的釋放應引起足夠的重視。在反硝化過程中，N2O作為中間產物出現，通常認為其是不完全反硝化作用的產物[25]。

通過上述分析，未來可以采用基因工程的手段改造反硝化相關酶的表達從而減少N2O的釋放，將硝酸鹽還原酶、亞硝酸鹽還原酶、一氧化氮還原酶、氧化亞氮還原酶串聯在受同一個強啟動子調控的操縱子上，在亞硝酸鹽還原為NO和N2O后直接還原為無害的N2釋放到空氣中。同時也提供了一種篩選高效固氮菌的重要參考指標，以獲得釋放少量N2O的固氮菌。綜上，降低N2O排放到環境中引起的二次污染，減少溫室效應，建立更加高效綠色的污水脫氮工藝，同時有效控制溫室氣體的排放，具有重大的社會、環境和經濟意義。