侵染滇黃精的菜豆普通花葉病毒的檢測與鑒定

陳澤歷, 楊林毅, 陳 潞, 孫 雁, 魏朝霞, 李永忠, 趙明富*, 文國松*

1.云南農業大學農學與生物技術學院, 昆明 650201；2.云南農業大學, 農業生物多樣性與病蟲害控制教育部重點實驗室, 昆明 650201;3.云南農業大學煙草學院, 昆明 650201

滇黃精(Polygonatumkingianum)是百合科(Liliaceae)黃精屬多年生草本藥用植物，以根莖入藥。《中國藥典》規定滇黃精(Polygonatumkingianum)、黃精(Polygouatumsibiricum)、多花黃精(Polygouatumcyrtouema)為中藥黃精的3種基源植物，俗稱“大黃精”、“雞頭黃精”和“姜形黃精”，具有補益健脾、補氣潤肺、滋陰生津、補腎等功效[1]。野生滇黃精多生于林下、灌叢或陰濕草坡，有時生巖石上，主要分布于云南、四川、廣西、貴州等省區。滇黃精中含有多種有效成分:滇黃精多糖(Polygonatumkingianumpolysaccharide，PKP)具有降血糖、降血脂、調節免疫等功效；總皂苷可改善學習記憶力、抗抑郁，也可調節血糖；黃酮類成分是黃精屬植物的特征性成分，總黃酮具有抗氧化活性[2,3]。臨床上常用滇黃精治療脾氣虧虛型血虛癥、貧血癥、高尿酸血癥、痛風、頑固性咳嗽、小兒脾胃病以及男子不育癥等[4,5]。近年來，隨著對滇黃精研究的不斷深入，其應用領域不斷拓展，市場需求量也相應增加。野生滇黃精居群植株分布頻度已接近稀少或枯竭[6]，因而人工種植產業得到發展，但大面積單一種植易使滇黃精發生較為嚴重的病害。目前已報道的滇黃精病害，如葉斑病、炭疽病、黑斑病等真菌性病害，嚴重影響著其藥材產量和品質[7]，但滇黃精病毒病未見報道。

菜豆普通花葉病毒(Beancommonmosaicvirus，BCMV)屬于馬鈴薯Y病毒科(Potyviridae)馬鈴薯Y病毒屬(Potyvirus)成員，最早是從被侵染的菜豆植株中分離獲得的[8]，1934年Pierce[9]將其正式命名為BCMV。馬鈴薯Y病毒屬成員的病毒粒子呈線狀，大小為(680～900) nm×(11～13) nm[10]。BCMV基因組是1條全長約為9.6～10 kb的(+)ssRNA，結構特征與典型的Potyvirus成員相同，5′端具病毒基因組連接蛋白(virus genome linked protein，VPg)，3′端具有Poly(A)尾，在5′-UTR和3′-UTR之間含有1個開放閱讀框(open reading frame，ORF)，編碼分子量約為350 kDa的具有蛋白酶活性的多聚蛋白，該多聚蛋白可被蛋白酶(P1、HC-Pro、NIa)切割產生10個成熟蛋白[11]。BCMV在全世界范圍內均有分布，傳播途徑較多，主要經蚜蟲非持久性傳播，還可通過機械接種、種子和花粉傳播。其寄主范圍廣泛，可侵染藜科、茄科、莧科、豆科、番杏科等9科44屬的約100多種植物[12,13]，感病組織細胞質中可觀測到圓柱狀內含體在組織橫切面呈風輪狀結構[12]，而植物受侵染后通常表現為花葉、葉片皺縮或變窄、植株矮化，豆科植物出現豆莢斑駁或畸形，造成嚴重的經濟損失[14,15]。

在本課題組前期調查滇黃精病害過程中，發現田間部分滇黃精表現出明顯的花葉、葉片皺縮癥狀，與已報道的3種真菌性病害癥狀描述不同，而疑似病毒病，但此前未見BCMV侵染黃精屬植物的報道。因此，為了鑒定引起該癥狀的病原，本研究結合電鏡技術、血清學檢測技術和RT-PCR技術對云南文山出現花葉、皺縮癥狀的滇黃精病樣進行檢測和鑒定，以期為后續滇黃精病毒病害的防治提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

病樣于2017年8月～9月采集自云南文山。在種植基地觀察到侵染癥狀的滇黃精，拍照并收集疑似病毒侵染的植株，以其為樣品進行病毒粒子提純觀察以及DAS-ELISA、RT-PCR檢測。DAS-ELISA檢測所用3份滇黃精病樣編號為DHJ1、DHJ2、DHJ3。

BCMV的ELISA試劑盒購自美國Creative Diagnostics公司，pGEM-TeasyPCR產物克隆試劑盒購自美國Promega公司，植物總RNA提取試劑盒、M-MLV反轉錄酶、RNase抑制劑、dNTPS、2×PowerTaqPCR Master Mix試劑盒等均購自北京百泰克生物技術有限公司，其他化學藥品均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

JEM-1200EXII透射電鏡(日本電子株式會社)；CCD相機(美國GATAN公司)；ABI PRISMTM 377 DNA自動測序儀測定(生工生物工程(上海)股份有限公司)。

1.3 BCMV病毒粒子電鏡觀察

取呈現花葉、皺縮癥狀明顯的滇黃精病葉進行病毒粒子提純，提純參照Zhao等[16]的方法。提純的病毒粒子用浸出法在電子顯微鏡下觀察：用鋪有Formver膜的電鏡銅網沾取病毒粗提純液，用吸水紙吸干，加1滴2%磷鎢酸(pH 7.0)負染1 min，吸干，待干燥后用JEM-1200EXII透射電鏡觀察，并用GATAN CCD相機拍照。

1.4 血清學檢測

取呈現花葉、皺縮癥狀明顯的滇黃精病葉制樣進行血清學測定。向樣品中加入15倍體積的抽提緩沖液研磨，8 000 r/min離心5 min，取上清液作為待測樣品。血清學測定采用DAS-ELISA，用抗BCMV的抗體，檢測步驟按照BCMV ELISA Kit說明書進行。陽性對照來自于BCMV ELISA試劑盒，以健康滇黃精葉片為陰性對照，以緩沖液為空白對照。

1.5 病樣總RNA抽提和PCR擴增

病樣總RNA抽提采用離心柱型通用植物總RNA提取試劑盒，具體方法按說明書操作。PCR擴增引物為馬鈴薯Y病毒科特異性簡并引物(Sprimer/M4T)[16]。

抽提所得總RNA用于合成cDNA第一鏈，合成所用引物為M4T，總體系20 μL：總RNA 5 μL，引物M4T 1 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 1 μL，RNase Free ddH2O 7 μL，混勻后，于65℃溫育5 min，置于冰上急冷，再加入5×first-strand Buffer 4 μL，200 U/μL M-MuLV Reverse Transcriptase 1 μL，40 U/μL RNase Inhibitor 1 μL。逆轉錄反應程序為：30℃ 10 min，42℃ 60 min，95℃ 5 min，所得cDNA產物用于PCR擴增。隨后采用2×PowerTaqPCR Master Mix試劑盒，反應體系參照說明書，反應體系(50 μL)：2×PowerTaqPCR Master Mix 25 μL，上游引物(Sprimer)5 μL，下游引物(M4T)5 μL，模板 2 μL，ddH2O 13 μL。反應程序：95℃ 3 min；95℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 1 min，共30個循環；72℃ 10 min。最后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶。

1.6 克隆和序列分析

將PCR產物直接克隆到載體pGEM-T Easy vector[16]。采用ABI PRISMTM 377 DNA自動測序儀測定，序列分析采用DNAMAN和MEGA 7.0。

2 結果與分析

2.1 發病概況及典型癥狀

為了明確引起滇黃精疑似病毒病癥狀的病原，本研究對云南文山種植基地的滇黃精進行病害調查，發現滇黃精病毒病大田發病率在9%～13%，正常植株葉片呈均勻的綠色、葉面平滑，植株健壯，而發病植株葉片呈花葉、皺縮癥狀，并且植株細弱(圖1)。

2.2 電鏡觀察病毒粒子形態

將呈花葉、皺縮癥狀明顯的滇黃精病葉提純病毒粒子后，提純的病毒粒子用浸出法在電子顯微鏡下觀察，可觀察到直線或彎曲線狀病毒粒子，大小為(670～760) nm×(9～12) nm(圖2)。而馬鈴薯Y病毒屬成員的病毒粒子也為線狀，由此推測滇黃精病樣中可能含有該屬病毒。

2.3 血清學檢測

取侵染癥狀明顯的滇黃精病葉，用抗BCMV的抗體進行DAS-ELISA檢測，發現3份待測樣品的OD405值分別為1.542、1.633、1.598，空白對照和陰性對照的OD405值分別為0.09和0.102，陽性對照OD405值為1.472(表1)，結果表明DHJ1、DHJ2和DHJ3與抗BCMV的抗體呈強陽性反應，可初步判定DHJ1、DHJ2和DHJ3可能含有BCMV。

圖1 滇黃精正常植株與田間自然發病植株Fig.1 Normal plant and plant naturally infected with BCMV of Polygonatum kingianum.

圖2 從滇黃精病樣提取的線狀病毒粒子Fig.2 Viral particles of BCMV purified from diseased leaves of Polygonatum kingianum.

2.4 PCR產物電泳檢測及測序分析

為了進一步確定經ELISA檢測的滇黃精是否的確存在BCMV，取ELISA檢測呈陽性的病樣DHJ1，進行RT-PCR驗證。利用馬鈴薯Y病毒科屬簡并引物(Sprimer/M4T)進行擴增，結果擴增出大小約為1 700 bp的目的條帶。對目的條帶克隆并測序分析，結果表明，該PCR產物序列長為1 609 bp，包括部分NIb基因(588 bp)、CP基因(864 bp)和3′-UTR序列(157 bp)。在NIb蛋白的第30～32位存在保守基序GDD，推測NIb/CP裂解位點為VHLQ/SG(第193～198位)，CP氨基酸序列第208～210位存在與蚜傳密切相關的保守基序DAG(圖3)。滇黃精分離物，命名為BCMV-DHJ1，與已經報道的BCMV湖北大豆分離物(KJ807813)、山東花生分離物(Laixi isolate，KF439722)、山東花生分離物(TA11 isolate，HM776124)、浙江花生分離物(AJ889245)核苷酸序列同源性為91%～99%，相應區域NIb蛋白氨基酸序列同源性為99%～100%，CP氨基酸序列同源性為99%～100%(表2)。進一步分析菜豆普通花葉病毒滇黃精分離物BCMV-DHJ1與其他BCMV分離物的進化關系，利用MEGA 7.0軟件構建該分離物和已報道的其他BCMV分離物CP氨基酸序列系統進化樹(圖4)，進行系統發育分析。結果顯示BCMV-DHJ1與中國、美國、韓國、越南的分離物聚類為一簇，與花生(HM776124)和大豆(KJ807813)分離物親緣關系最近，CP氨基酸序列同源性為99%～100%。

表1 DAS-ELISA檢測結果Table 1 The detection results of DAS-ELISA.

表2 BCMV-DHJ1與其他BCMV分離物3′-端相應區域核苷酸序列和CP基因編碼的蛋白氨基酸同源性比較Table 2 Comparisons of the 3′nucleotide sequences identity and animo acid sequences identity of CP among BCMV-DHJ1 and other BCMV isolates.

圖3 BCMV-DHJ1分離物基因組3′-末端相應區域核苷酸及其編碼的氨基酸序列Fig.3 The nucleotides and putative amino acids of the 3′-end in BCMV-DHJ1 genome.

3 討論

根據不同Potyvirus屬成員的CP氨基酸同源性應低于80%的分類標準，Potyvirus屬成員外殼蛋白核心區域的同源性低于65%時病毒分離物屬于不同種，同源性在72%～90%之間屬于同一病毒的不同分離物[17,18]。結合電鏡觀察到的病毒粒子形態以及DAS-ELISA檢測、病毒基因組3′-末端序列同源性分析和CP氨基酸序列系統發育分析的結果，表明引起滇黃精花葉、皺縮癥狀的病毒病原為BCMV。這是首次報道BCMV自然侵染滇黃精，因此將該病毒命名為菜豆普通花葉病毒滇黃精Ⅰ號分離物(BCMV-DHJ1)。該結果可為滇黃精病毒病害的生物防治及健康種苗繁育提供理論基礎。

作為植物病毒檢測的常用方法，PCR檢測和ELISA檢測2種方法各有所長，不可相互替代，為避免實驗出現假陽性或者假陰性結果，2種方法要相互驗證，直到取得一致結果。本研究對葉片呈現花葉、皺縮癥狀的滇黃精樣品進行檢測，利用2種方法均驗證了BCMV的存在。

圖4 基于已報道的BCMV外殼蛋白(CP)氨基酸序列構建的系統樹Fig.4 Phylogenetic trees based on CP amino acid sequences of the previously reported BCMV isolates.

BCMV為馬鈴薯Y病毒屬的重要成員，是豆科作物重要病毒之一，最早在美國報道[8]，在世界范圍內都有分布[19]。BCMV除能侵染豆科外，還可侵染藜科、茄科和莧科等植物，給農業經濟造成重大損失[13]。該病毒可經桃蚜、棉蚜以非持久性方式傳毒，還可通過種子和花粉傳播[12]。馬鈴薯Y病毒屬Potyvirus多聚蛋白可被病毒基因組編碼的3種蛋白酶(P1、HC-Pro、NIa)分解為10個較小的成熟蛋白，NIa-Pro蛋白酶負責切割多聚蛋白前體中-端的CI/6K2、NIa/NIb等多個酶切位點，裂解位點的識別模式均為V-X-X-Q(或E)-(A、S、G或V)，本研究中BCMV-DHJ1分離物氨基酸序列的NIb/CP裂解位點推測為VHLQ/SG，位于NIb蛋白第193～198位。Potyvirus成員的NIb蛋白從N端到C端含有GDD和GNNSGQPSTVVDNT等高度保守結構域。在這一區域，高度保守的GDD基序如果發生突變，突變為ADD后，依賴于RNA的RNA復制酶的酶活性降低，僅有野生型的7%。GDD保守區在結構上類似于ATP和GTP結合酶類的B保守區NTP結合位點，是所有動物、植物以及細菌、病毒依賴于RNA的RNA聚合酶的特征性保守序列[20]。CP蛋白與RNA包裝、寄主范圍及蚜傳和癥狀誘導等功能有關，其N端的保守基序DAG與蚜傳研究比較多，如果保守基序DAG發生突變，病毒的蚜傳能力將受到影響，會部分或者全部喪失[21～25]。本研究中NIb蛋白的第30～32位存在保守基序GDD，CP蛋白第215～217位存在與蚜傳密切相關的保守基序DAG。因此，蚜蟲是否傳播BCMV-DHJ1以及哪種蚜蟲傳播值得深入研究，另外BCMV在滇黃精上是否種傳也有待研究。