根瘤菌誘變育種在根瘤菌-豆科植物共生體系中的研究進展

王艷霞, 解志紅

1.中國科學院煙臺海岸帶研究所, 山東 煙臺 264003;2.中國科學院大學, 北京 100049

根瘤菌與豆科植物共生形成根瘤，當豆科植物產生的黃酮類化合物誘導根瘤菌合成一種分子信號——Nod因子時，共生就開始了，Nod因子刺激根部細胞分裂，導致根瘤器官發生；根瘤菌通過侵入線進入發育中的根瘤細胞，被植物宿主細胞在內吞過程中吸收，并分化為一種獨特的類菌體結構，在根瘤內，類菌體通過固氮酶固定大氣中的分子氮為豆科植物提供生長所需的氨，植物為類菌體提供碳源，這些碳源被分解以提供固氮所需的能量[1～4]。基于這一共生固氮體系來應對各種環境脅迫進而穩定生態的植物-微生物修復方法已被證明是一種經濟可靠且可持續的方法，然而環境因子的限制也是其不能在農業生產上充分發揮作用的重要原因，其中包括土壤營養不足、重金屬毒性、土壤鹽堿化以及農藥污染等限制因子[5～7]。利用豆科植物-根瘤菌共生體系中的固氮作用來提高土壤氮素含量水平并且提高對各種環境因子的耐受力，一直是科研工作者進行土壤恢復的手段之一。

要大幅度提高根瘤菌在生態修復中的應用效果，目前面臨的主要問題是：通過何種方法選育出高效固氮的根瘤菌株，來進一步提高根瘤菌的固氮能力、結瘤能力以及抗逆能力等。因此本文圍繞通過誘變育種來提高根瘤菌的固氮能力以及在不同環境下的耐受性的相關問題，對國內外相關研究進展進行了歸納總結與分析，探討了目前存在的一些問題并展望了本領域未來的研究趨向。

1 根瘤菌及其與豆科植物的共生

根瘤菌是指一類能與豆科植物共生、結瘤并固定空氣中的氮氣供植物營養的重要微生物。它與豆科植物的共生固氮體系是目前微生物與植物之間固氮能力最強、固氮量大、耐受性強的互惠共生關系之一[8]。眾所周知,利用根瘤菌和豆科植物共生固氮作用可以增加土壤氮素含量，進而恢復干旱和退化土地的肥力。近幾年來，國內外開展了大量對根瘤菌、豆科植物及二者共生體系的研究，其應用主要圍繞在將根瘤菌-豆科植物共生體系應用于重金屬污染地、農田鹽堿地、農藥污染地等的生態修復中[9]。

特別是研究者們對根瘤菌自身的重金屬抗性、耐鹽性及耐酸堿性進行了深入的研究。例如利用豆科植物與根瘤菌共生來減輕重金屬的毒性，使植物對過量金屬的耐受性更強，并且使植物生物量、發芽率、伸長率、抗氧化能力和金屬易位都有所增加[10]。Sánchez 等[11]研究發現，在豆科植物大豆與白羽扇豆上接種慢生型根瘤菌(Bradyrhizobium)，能夠促進銅的生物積累并促使其從植物地下部分向地上部分轉移，并且減輕了銅對植物的生長抑制，同時增強了植物對過量銅的耐受性。楊培志[12]發現接種根瘤菌可大幅度提高紫花苜蓿對干旱、鹽害、高溫及根部機械損傷等非生物脅迫的耐受性。然而大多數根瘤菌和豆科植物對重金屬等環境因子是非常敏感的，例如當土壤等環境中重金屬含量過高時，會破壞根瘤菌細胞內各種生理代謝，包括細胞膜破壞而影響營養物質運輸、抑制轉錄和翻譯而影響酶活性以及蛋白質變性等(圖1)，因此這些重金屬等環境因子對豆科植物和根瘤菌之間互作的影響機制目前還有待進一步研究[14,15]。Sánchez等[16]也發現過量的銅會引起白色羽扇豆和大豆根瘤結節的超微結構損傷，并且限制氮的固定。Benidire等[17]通過研究鹽脅迫下不同耐鹽性根瘤菌與蠶豆生長的相互關系，發現在較高鹽濃度下，接種鹽敏感菌株的蠶豆植株的結瘤被抑制，并且固氮能力也較弱。

為了充分發揮根瘤菌在其與豆科植物共生體系中的固氮能力、結瘤能力以及抗逆能力，國內外科學家們逐步開展根瘤菌高效菌株的選育研究工作，尤其是在誘變育種上開展了大量研究。

圖1 重金屬含量過高對菌體細胞的毒害效應[13]Fig.1 Toxic effects of excessive heavy metal content on bacterial cells[13].

2 根瘤菌的誘變育種

誘變育種是指利用外界物理化學生物因子等因素誘導微生物細胞的基因突變，經誘變處理后，會改變微生物遺傳物質DNA和RNA的化學結構，從而引起微生物的遺傳變異，并通過某些篩選方法獲得所需要的高產、穩產和低耗菌株[18,19]。常規的微生物誘變育種程序一般按照圖2所示步驟進行。誘變育種方法主要包括化學誘變、物理誘變和生物誘變。

大部分根瘤菌的菌體革蘭氏染色呈陰性，無芽胞，有莢膜，具鞭毛，能運動，其菌落一般呈圓形，顏色大多為乳白色，半透明，邊緣光滑整齊，粘稠性較小，在油鏡下觀察，一般為(0.5～0.9)μm× (1.2～3.0)μm的短桿菌，經誘變后根瘤菌細胞會出現放大或變形[20,21]。鑒于大多數根瘤菌具有嚴格的宿主專一性，針對不同植物依靠大規模傳統篩選發揮固氮和耐受能力都較為突出的理想菌株難度較大[22]。因此，在生產實踐中，一般會通過一些誘變方法來獲得理想的突變菌株。由于誘變育種具有變異頻率高、技術簡單、速度快等優點，已經廣泛應用于大部分科學研究和工業生產中。趙志山等[23]利用不同劑量快中子的照射來誘變小金黃大豆根瘤菌，發現經誘變根瘤菌侵染的植株的結瘤數、結瘤能力都有顯著提高，固氮活力也有不同程度的變化，固氮能力顯著增強。除固氮能力外，菌種的耐受能力在誘變選育下也得到提高，同時通過對耐鹽基因的挖掘，有助于我們進一步了解其耐鹽機理。秦家順等[24]在一定條件下用紫外線誘變豇豆根瘤菌，由此產生的誘變菌株具有較高地合成IAA的能力，而且其耐鹽堿性也有明顯提高。Jiang等[25]通過對1株具有耐鹽性的中華根瘤菌(Sinorhizobiumfredii)進行轉座子Tn5-1063誘變，獲得21個鹽敏感突變體，測序鑒定了5個不同的耐鹽基因，這對研究提高鹽敏感根瘤菌的耐鹽性具有重要意義。

圖2 誘變育種一般工作程序Fig.2 General working procedures of mutagenesis breeding.

2.1 物理誘變

物理誘變是借助不同的輻射源對微生物進行電離或非電離輻射，是一種應用較早、安全性較高、操作較簡便且誘變頻率較高的誘變技術[26]。到目前為止，國內外利用物理誘變技術對根瘤菌進行遺傳改造的研究已經取得了許多成果，并且在工業生產中得到了一定推廣，其中主要誘變因素有激光、紫外線、快中子、微波、離子束等。黃懷瓊[27]利用CO2激光輻照處理苕子根瘤菌株，經富集培養分離出誘變菌株，獲得結瘤和固氮能力強的誘變菌株；同時分別利用 N2激光和 CO2激光處理慢生型花生根瘤菌株，獲得感染力和結瘤性能均優于原菌株的誘變菌株，并且誘變菌株對植物的敏感性較原菌株強，植株的含氮量也有所增加，抗逆性增強。陳今朝等[28]利用一定劑量的紫外線對四季豆、豌豆和花生根瘤菌照射后，發現所有根瘤菌誘變菌株均出現了形態特征和抗性(抗酸堿和抗鹽)的改變。

傳統的物理因子對根瘤菌的誘變作用強烈，但是可能出現正誘變類型少、誘變株的遺傳穩定性較差等現象。近年來，微波誘變、離子注入以及常壓室溫等離子體(atmospheric room temperature plasma,ARTP)等新型誘變方法由于其安全性和易獲得更高的正突變率而在根瘤菌誘變育種中開始應用。李劍峰等[29]利用較高功率的微波誘變紅豆草根瘤菌，獲得了具有抗生素耐受特性、突變率最高達19%、單株結瘤數高于原始菌株和單株生物量顯著增加的誘變菌株，并且顯著提高了根瘤菌的固氮結瘤能力。白建軍[20]通過對1株山羊豆根瘤菌進行He+注入誘變試驗，確定了在250W功率射頻下，He+注入15 s時，誘變效果最好，經過SPAD測定發現誘變后菌株的固氮效果顯著提高。Cai等[30]采用常壓室溫等離子體新型誘變技術對苜蓿根瘤菌進行誘變，獲得了大量突變菌株，與野生菌株相比，突變株的產VB12能力顯著提高，同時對高產突變株的基因組進行測序。付瑞敏等[31]通過低能N+注入誘變技術對高效耐鹽石油降解菌株進行誘變處理，獲得的突變株不僅遺傳性能穩定，而且其耐鹽能力和降解石油烴的能力均有較大幅度提升。因此，對根瘤菌進行等離子體誘變育種，并將其應用于修復石油污染的鹽漬化土壤具有一定的可行性。

2.2 化學誘變

化學誘變一般是利用各種化學試劑，例如亞硝基胍(nitrosoguanidine,NTG)、嘧啶類似物以及吖啶橙等對菌種進行處理。作為一種經典而傳統的誘變方法，它被廣泛應用于優良菌種的選育工作中，但此方法具有一定的盲目性、隨機性以及污染性，在根瘤菌誘變育種中的應用相對較少，并一般采用亞硝基胍作為誘變劑。曹燕珍等[32]利用亞硝基弧誘變紫云英根瘤菌，發現隨著濃度的提高，誘變株對宿主的感染力明顯增強。近年來，研究者也已經利用這一誘變方法獲得了能夠高效固氮的根瘤菌株。張憲武等[33]利用亞硝基弧誘變法獲得的大豆根瘤菌突變株具有自身固氮能力，固氮活性高出野生菌株3倍以上。龍敏南等[34]利用吖啶橙誘變花生根瘤菌，篩選出了能使大豆結瘤并具有較高固氮酶活性的根瘤菌誘變株。

利用各種化學誘變劑對微生物進行誘變，操作簡便、效果良好、誘變機制比較清晰，它不僅可以誘導微生物產生點突變，而且會導致諸如染色體畸變等的DNA大損傷，但是其最顯著的缺點是毒性較大，極易對人體產生危害，因此操作時需加倍小心。目前在根瘤菌的化學誘變中，還沒有出現新型的誘變劑，多采用多種化學或物理誘變因子組合的復合誘變方法[35]。

2.3 生物誘變

生物誘變多是以轉座子及其衍生物、噬菌體等生物性產品為介質的誘變，尤其是利用轉座子的誘變方法在根瘤菌誘變育種研究中被大量應用。通常以Tn5系列的轉座子作為轉座元件進行誘變，這種轉座子是一種常用的在轉座過程中有整合體的剪-貼型轉座子(圖3)，具有轉座頻率高、轉座位點隨機、轉座后穩定性強以及抗性標記易于篩選等優點。

許多研究者已經利用轉座子對不同根瘤菌進行了誘變(表1)。杜秉海等[37]利用含發光酶基因luxAB的Tn5-1063對苜蓿中華根瘤菌(Sinorhizobiummeliloti)進行轉座子插入誘變，通過結瘤實驗篩選出了3個結瘤突變株，其結瘤固氮能力都發生了不同程度的改變。利用轉座子誘變不僅可以改變根瘤菌的結瘤固氮能力，而且通過篩選到的敏感性菌株能夠進一步研究根瘤菌抗逆性機制。Wahyudi等[36]利用mini-Tn5轉座子衍生物誘變慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobiumjaponicum)，獲得了兩株對鋁酸敏感的突變株并且用以研究慢生型大豆根瘤菌的耐鋁酸相關基因，發現耐鋁酸基因與結瘤基因并不相關，同時在鋁酸脅迫條件下，根瘤菌的耐鋁酸機制可能與細菌細胞中鋁和磷酸鹽的含量有關。馬占強[41]利用Tn5-1063a轉座子隨機誘變苜蓿中華根瘤菌CCNWSX0020，經重金屬抗性測定表明篩選出的6株誘變株對Cd和Zn都表現出不同的敏感性，也有4株誘變株對Pb表現出敏感性，并且通過基因測序鑒定了4個與銅抗性相關基因，首次證明了這些基因與苜蓿中華根瘤菌CCNWSX0020抗銅性有關。Liang等[42]利用Tn5轉座子對遼寧慢生根瘤菌(Bradyrhizobiumliaoningense)CCNWSX0360 進行隨機誘變，分離篩選得到6株銅敏感突變體，并通過鑒定5個銅抗性相關基因，研究了根瘤菌中的銅抗性機制，發現csoR-cueA在銅穩態中起著至關重要的作用，并具有抗鋅鎘的能力，以及鋁脅迫下CueA(重金屬轉運P型ATP酶)在共生結瘤中發揮重要的作用。Rubio-Sanz等[40]從重金屬污染土壤中分離篩選出了1株耐受鎳和鈷的豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarumbv. viciae)，然后對其進行隨機微轉座子誘變，產生了14個鎳敏感性增加的轉座子衍生物，其中有5個轉座子對鈷更加敏感；同時對基于共生條件下的菌株重金屬耐受性的決定因素進行了分析。Hao等[39]通過Tn5轉座子誘變紫穗槐中間根瘤菌(Mesorhizobiumamorphae)，產生的銅敏感突變體闡明了在銅脅迫下耐銅性決定因素在共生和植物穩定能力方面的作用；在含銅200 mg/kg的土壤中，接種copA缺陷型菌株能夠顯著降低刺槐根部結節的氮含量，這一結果表明在高濃度銅的土壤和結節中，根瘤菌經誘變所產生的對銅的耐受性相應地有益于氮固定能力。Moussaid等[38]通過Tn5隨機轉座子誘變一株具有鹽敏感性的鷹嘴豆中慢生根瘤菌(Mesorhizobiumciceri)Rch125，分離出12個同時對LiCl、CaCl2和蔗糖顯示出更高耐受性的耐鹽突變體，經鑒定特定基因功能的喪失會導致鹽敏感性根瘤菌的耐鹽性增加。Vanderlinde等[43]利用mini-Tn5轉座子衍生物來對豌豆根瘤菌進行誘變并分離出一株對干旱非常敏感的突變體，同時與野生菌株相比，該突變體細胞膜中的胞外多糖水平降低，這與耐干旱性降低有關，這項發現對豆科植物在根際環境中的生存具有重要意義。近年來也有研究利用轉座子誘變獲得的耐藥性菌株并應用于生產中。Neeraj等[44]對1株中華根瘤菌(Sinorhizobiumfreddi)進行Tn5轉座子的隨機誘變處理，發現在較低溫度下獲得耐藥性菌株的幾率遠高于其自然突變率，并以此耐藥性菌株制成的根瘤菌劑的研究也取得了良好的效果。

圖3 剪-貼型轉座子插入機制Fig.3 Shear-paste transposon insertion mechanism.

表1 不同根瘤菌的轉座子誘變育種Table 1 Transposon mutation breeding of different rhizobium.

2.4 復合誘變

菌種誘變機制比較復雜，單一誘變往往難以達到預期目的。因此，目前也有研究者在進行根瘤菌誘變育種時往往采用2 種或者2 種以上誘變劑協同組合的育種方法，即復合誘變法。這種方法可在一定程度上提高誘變的目的性和針對性，并且更容易篩選到具有有利性狀的正向突變菌株，因此越來越廣泛應用于相關誘變育種研究中。Pan等[45]對放射型根瘤菌(Rhizobiumradiobacter)先用紫外線照射再用NTG處理，正突變率提高，輔酶Q10的產量增幅也變大，試驗證明紫外線與NTG協同復合誘變的效果要優于單獨紫外線照射或NTG誘變。曹燕妮[46]通過紫外一氯化鋰和超聲波處理對豌豆根瘤菌(Rhizobiumleguminosarum)進行誘變，發現氯化鋰作為助誘劑能顯著提高正突變率，并且增加正突變菌株數量。Liu等[47]對魯氏酵母菌(CRZ-0)進行紫外-硫酸二乙酯(UV-DES)協同誘變處理，獲得了Cd2+抗性及生物累積能力提高的誘變菌株。楊利擎[47]利用多種誘變方法對具有重金屬耐受性的菌株進行誘變育種，篩選獲得的誘變株的重金屬耐受能力增強，在進行菌種鑒定后用于處理重金屬污染[48]。夏錢華等[49]通過紫外-微波復合誘變，對石油降解菌Enterobactersp. MX1進行誘變，獲得的誘變株MXU2W2 降解柴油率比原菌提高了16.96%。有研究者利用γ-射線、微波和化學誘變劑復合處理花生和大豆根瘤菌，接種到玉米和小麥上，顯著提高了植株的結瘤數[50]。

3 展望

根瘤菌的誘變育種研究在改善豆科植物-根瘤菌共生效應中具有重大意義，不僅可以提高植株的結瘤固氮能力，而且也提高了根瘤菌的抗逆性。目前，根瘤菌的選育手段除了上文提到的誘變育種技術還有一些新型的選育技術，例如：原生質體融合技術、基因工程技術等，但由于各種現實條件的限制，包括外界環境限制、基礎知識薄弱、研究投資大、技術門檻高等，這些新型選育技術的研究較少，也很難應用于大規模生產中。因此，常規的誘變和篩選方法在根瘤菌育種工作中仍被廣泛使用，依舊占主導地位。

伴隨國內外研究的不斷深入，根瘤菌誘變育種技術也逐漸從研究試驗階段走向了實際應用，但在具體研究應用中始終存在著一些問題，如有關根瘤菌誘變原理等基礎領域方面的研究還較少，導致國內對于這一根瘤菌選育方法的應用范圍不夠廣泛；誘變菌的不穩定及其使用安全性等問題需進一步克服和完善；誘變菌固氮能力及抗逆性在后續傳代中的遺傳穩定性問題；以及如何在研究中提高誘變菌的篩選效率并且獲得增效誘變等等。因此，目前科研工作者仍需要加強對根瘤菌與植物之間共生固氮作用提高抗逆性的機理以及根瘤菌誘變機理等基礎性研究，進一步開發設計根瘤菌的高效篩選技術例如高通量篩選技術，以縮短育種周期和降低成本，并提高篩選效率，同時要積極探索定向誘變途徑。隨著育種學、遺傳學、分子生物學、生物信息學以及系統學等學科的飛速發展、互相滲透與合作，將促進高效固氮抗逆根瘤菌的菌種選育工作從傳統的經驗性隨機篩選演變為更加嚴密、合理的系統化選育。也將會出現大量具有實用價值的高效固氮抗逆根瘤菌菌種，并不斷形成應用于生產實際的優良多效的根瘤菌劑產品。