無尾果醇提物對類風濕性關節炎大鼠的影響

高燕萍， 魏榮銳， 吳 強， 張亞梅， 鐘囯躍

（1.江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心，江西南昌330000；2.江西中醫藥大學科技學院，江西南昌 330000）

無尾果Coluria longifolia Maxim.是薔薇科無尾果屬植物，為藏藥 “熱袞巴”主要來源品種之一，產于我國甘肅、青海、云南、西藏等地，生于海拔2 700～4 100 m的區域，可用于治療頭痛、眩暈、肝陽上亢、月經不調、疝氣。目前，鮮有無尾果及同屬其他植物化學成分及藥理作用的報道，課題組前期從其全草中分離鑒定出5個三萜［1］和一些黃酮類化合物［2-3］；魏春華等［4］發現它具有顯著的抗炎、鎮痛、解熱作用，其中抗炎作用與提高抗氧化能力、抑制脂質過氧化、抑制炎癥因子TNF-α、PGE2釋放有關。

“熱袞巴”最早記載于 《月王藥診》“傷科外敷藥和內服藥”中，《四部醫典》《概念讓釋》《晶珠本草》等藏醫藥古籍文獻中也均有記載，具有祛淤血、清熱消炎等功效，臨床常用于治療類風濕性關節炎。近年來，隨著人們對類風濕性關節炎的深入研究，發現Ⅱ型膠原誘導關節炎（CIA）大鼠的遺傳背景和免疫病理學改變與臨床類風濕性關節炎在臨床表現、病理學、免疫學改變、發病機制等方面存在許多相似特征［5］； 陳哲等［6］報道， 4～5周齡的Wistar大鼠構建Ⅱ型膠原誘導類風濕性關節炎模型時，建模成功率達83.3%。目前認為，TNF-α直接參與了類風濕性關節炎關節及關節軟骨的炎癥和破壞，而NF-κB通路是病情進展中滑膜炎癥重要信號通路，在炎性反應、血管形成中發揮重要作用［7-8］。

因此，本實驗研究無尾果醇提物對類風濕性關節炎大鼠的影響，并基于NF-κB通路對其作用機制進行初步研究，為該藏藥開發利用及藥效物質、質量控制研究提供依據。

1 材料

1.1 試藥 無尾果購自成都荷花池藥材市場，經江西中醫藥大學鐘囯躍教授鑒定為薔薇科植物無尾果Coluria longifolia Maxim.，80%乙醇冷浸提取后濃縮，即得其醇提物。地塞米松注射劑 （浙江仙琚制藥股份有限公司，批號16 070 702 A）。 2 mg／mL溶于0.05 mol／L 冰醋酸的牛Ⅱ型膠原 （CⅡ）、不完全弗氏佐劑 （IFA） （美國Chondrex公司）；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2定量酶聯檢測試劑盒 （深圳達科為生物技術有限公司）；IκBα、p65抗體 （美國CST公司）；其余試劑均為市售分析純。

1.2 動物 SPF級Wistar大鼠，雄性，體質量（160±20）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，合格證號SCXK（湘） 2013-0002。

1.3 儀器 ELx800酶標儀 （美國BioTek公司）；Milli-Q（18.2 MΩ）超純水系統 （法國Millipore公司）；高速勻漿機 （德國IKA公司）；R-220SE旋轉蒸發儀 （瑞士Buchi公司）；大小鼠足趾容積測量儀 （美國IITC公司）。

2 方法

2.1 抗原制備 將牛Ⅱ型膠原蛋白按4 mg／mL質量濃度溶于10 mmol／L的冰醋酸中，攬拌均勻后置于4℃冰箱中過夜。然后，將其與等體積不完全弗氏佐劑 （IFA）混合，吸液槍反復抽吸至混合物完全乳化，置于4℃冰箱中保存備用。

2.2 模型制備 大鼠適應性飼養5 d，造模前1 d禁食不禁水12 h。先取乳化后的CⅡ與IFA，按 200 μg CⅡ／只的劑量在大鼠尾根部皮下注射，空白組大鼠同法注射生理鹽水；初次免疫7 d后再次加強免疫，按100 μg CⅡ ／只的劑量在大鼠尾根部不同部位注射膠原佐劑混合物，空白組大鼠同法注射生理鹽水。

2.3 分組及給藥 大鼠隨機分為空白組、模型組、地塞米松組 （0.5 mg／kg） 及醇提物高劑量 （300 mg／kg， 4.5 g生藥／kg）、 中劑量 （100 mg／kg， 1.5 g 生藥／kg）、 低劑量（30 mg／kg，0.5 g生藥／kg） 組， 每組 10只 ［醇提物單次口服給藥最大耐受量 （MTD）是1 000 mg／kg］。再次免疫后灌胃給藥，每2 d 1次，連續28 d，其中空白組、模型組給予生理鹽水。

2.4 指標檢測 造模第12天開始，測量大鼠左后足腫脹部位周長 （它與給藥前周長的差值作為腫脹度），每隔4 d記錄腫脹情況及體質量。末次給藥l h后動脈采血，取血清，－20℃下保存，按照試劑盒操作步驟測定血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2水平。然后，將大鼠踝關節進行福爾馬林固定、脫鈣、脫水、包埋、切片、HE染色等處理后，顯微鏡 （200倍）下觀察病理改變。

2.5 關節炎指數評分［9］造模后第8天開始，定期觀察并記錄全身關節病變程度，每4 d 1次，按5級評分法評價（0分：無紅腫；1分：趾關節紅腫；2分：趾關節和足趾腫脹；3分：趾關節以下的足爪腫脹；4分：包括踝關節在內的全部足爪腫脹），關節炎指數為2只后腿積分總和，最高8分。

2.6 IκBα、p65磷酸化水平檢測 采用Western Blot法檢測IκBα、p65磷酸化水平，考察兩者對NF-κB通路是否有調控作用。

2.7 統計學分析 通過SPSS 16.0軟件進行統計處理，結果以 （±s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 無尾果醇提物對大鼠體質量的影響 圖1顯示，與空白組比較，模型組大鼠體質量增幅隨著時間推移逐漸減??；與模型組比較，醇提物組其增幅有不同程度的提高。

圖1 無尾果醇提物對大鼠體質量的影響 （n＝10）

3.2 無尾果醇提物對大鼠關節的影響 圖2顯示，空白組大鼠踝關節無腫脹，各足趾粗細一致，趾間關節結構明顯；模型組大鼠踝關節嚴重腫脹，足底厚度明顯增大紅腫，各足趾粗細不一，趾間關鍵結構不明顯；地塞米松組大鼠踝關節腫脹程度明顯減輕，給藥1周后關節紅腫現象基本消失，但整個爪子很瘦；醇提物中、高劑量組大鼠足墊、踝關節腫脹程度明顯改善。關節炎指數見圖3。

圖2 各組大鼠足腫脹程度 （n＝10）

圖3 無尾果醇提物對大鼠關節炎指數的影響 （n＝10）

圖4 各組大鼠踝關節HE染色 （×200） （n＝10）

圖5 無尾果醇提物對大鼠TNF-α （A）、IL-1β （B）、IL-6（C）、IL-2（D） 水平的影響 （n＝10）

3.3 無尾果醇提物對大鼠組織病理變化的影響 圖4顯示，空白組大鼠關節軟骨面完整光滑，滑膜無腫脹；模型組大鼠有明顯的滑膜增生及炎性細胞浸潤，關節軟骨破壞明顯；地塞米松組大鼠滑膜較正常，基本無炎性細胞浸潤，關節間隙變窄；醇提物高劑量組滑膜較完整，炎性細胞浸潤較少，關節軟骨破壞明顯改善；醇劑量組炎性細胞浸潤明顯改善，有少量軟骨破壞；低劑量組滑膜增生不明顯，但軟骨有少量破壞。

3.4 無尾果醇提物對大鼠TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-2水平的影響 圖5顯示，與模型組比較，醇提物中、高劑量組TNF-α、 IL-1β、 IL-6水平顯著降低 （P＜0.01）， IL-2水平顯著升高 （P＜0.01）。

3.5 無尾果醇提物對大鼠 IκBα、p65磷酸化水平的影響 圖6顯示，與模型組比較，醇提物組IκBα、p65磷酸化水平顯著降低 （P＜0.01）。

圖6 無尾果醇提物對大鼠IκBα、p65磷酸化水平的影響（n＝10）

4 討論

類風濕性關節炎在藏醫中稱為 “真布病”，是一種以關節病變引起肢體畸形，特別是以關節滑膜組織慢性炎癥、滑膜增生病變及大量淋巴細胞、巨噬細胞浸潤為主要特征的慢性、全身性、反復發作自身免疫性疾病［10］，其病因尚未完全清楚。隨著分子生物學及免疫學飛速發展，大量資料表明T淋巴細胞、巨噬細胞、增生滑膜細胞在類風濕性關節炎的發病機制中起到主要作用，特別是所產生的促炎細胞因子 （如 IL-1β、 IL-6、 IL-2、 TNF-α 等）［11-14］。

本實驗發現，中、高劑量 （100、300 mg／kg）無尾果能明顯降低CIA大鼠足腫脹程度，顯著降低關節炎指數及血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平，升高 IL-2水平，而且可顯著降低 NF-κB通路關鍵蛋白 p65、IκBα磷酸化水平，推測其作用機制可能與NF-κB通路有關。雖然無尾果具有顯著的抗類風濕性關節炎活性，但其藥效物質基礎尚不明確，今后應加強相關研究，闡明其藥效物質基礎及分子作用機制，為該藏藥和抗類風濕關節炎藥物合理開發提供參考。