三叉苦質量標準的研究

甘杰華， 嚴 萍?， 馬 慶， 韓正洲， 詹若挺

（1.廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心，嶺南中藥資源教育部重點實驗室，國家中成藥工程技術研究中心南藥研發實驗室，廣東廣州510006；2.華潤三九醫藥股份有限公司，廣東深圳518002）

三叉苦 Melicope pteleifolia（Champion ex Bentham）T.G.Hartley為蕓香科蜜茱萸屬植物，又稱三丫苦、三椏苦，始載于 《嶺南采藥錄》，其性苦、寒，歸心、肝經，有清熱解毒、祛風除濕、消腫止痛等功效［1-2］，廣泛分布于我國廣東、廣西、海南、福建、云南等地［3-5］，在1977年版 《中國藥典》、《廣東省中藥材標準》 （第一冊）、 《廣西瑤族習用藥材質量標準》（第一卷）等標準中均有收錄［6-10］，其主要化學成分為生物堿、香豆素、揮發油、黃酮類等［10-15］。如今，三叉苦已廣泛應用于三九胃泰、三九感冒靈等多種中成藥中，但相關標準偏于簡單 （僅有性狀、顯微和理化鑒別），故本實驗對該藥材進行質量評價，以完善其質量標準，具有較好的實際意義。

1 材料

1.1 儀器 KQ-700DE超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；XR205SM-DR電子天平 （瑞士Precisa公司）；Ultimate 3000高效液相色譜儀 （美國賽默飛世爾科技公司）；薄層成像系統 （瑞士Camag公司）；Milipore-Q超純水系統 （美國Milipore公司）。

1.2 試藥 10 cm×20 cm硅膠GF254預制薄層板（德國默克公司）。N-反式-對香豆酰酪胺 （批號wkq16031101，含有量 98%）、茵芋堿 （批號wkq16030105，含有量 98%）、白鮮堿 （批號wkq16020304，含有量98%）均購自四川省維克奇生物科技有限公司；吳茱萸春堿 （自制，含有量＞98%）。三叉苦對照藥材 （批號 121682-201301）購自中國食品藥品檢定研究院；樣品藥材共20批（編號S1～S20，具體信息見表1），經廣州中醫藥大學中藥資源科學與工程研究中心詹若挺研究員鑒定為蕓香科蜜茱萸屬植物三叉苦Melicope pteleifolia（Champion ex Bentham）T.G.Hartley的干燥莖。乙腈 （德國默克公司）、磷酸 （美國阿拉丁公司）為色譜純；其他試劑均為分析純；水為自制超純水。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結果

2.1 TLC定性鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取藥材粉末5 g，加50 mL氯仿超聲提取 （40 kHz、280 W） 30 min，放冷，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加5 mL甲醇溶解，即得。

2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取吳茱萸春堿對照品適量，加甲醇制成每1 mL含0.2 mg該成分的溶液，即得。

2.1.3 鑒別方法 分別吸取供試品、對照品溶液6、4 μL，點于同一硅膠薄層板上，置于氨蒸氣預飽和的展開缸內 （溫度25℃，相對濕度60%），以石油醚 （60～90℃） -乙酸乙酯-乙醇 （6∶3.5∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈 （254 nm）下檢視，結果見圖1～2。由圖可知，供試品在對照品相應位置處顯相同顏色斑點，分離度良好。

圖1 三叉苦TLC色譜圖 （Ⅰ）Fig.1 TLC chromatogram of M．pteleifolia（Ⅰ）

圖2 三叉苦TLC色譜圖 （Ⅱ）Fig.2 TLC chromatogram of M．pteleifolia（Ⅱ）

2.2 水分、浸出物、總灰分、酸不溶性灰分含有量測定 按照2015版 《中國藥典》四部方法測定，結果見表2。

2.3 N-反式-對香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿含有量測定

2.3.1 色譜條件 Waters Xbridge HSS T3色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）； 流動相乙腈-0.1% 磷酸，梯度洗脫 （0～15 min，25%乙腈；15～60 min， 25% ～40%乙腈）； 體積流量 1.0 mL／min；柱溫25℃；檢測波長240 nm；進樣量10 μL。在上述色譜條件下，4種成分保留時間與對照品一致，分離度、拖尾因子符合要求，理論塔板數均達到5 000以上，色譜圖見圖3。

2.3.2 對照品溶液制備 精密稱取各對照品適量，加甲醇制成含N-反式-對香豆酰酪胺1.018 mg／mL、茵芋堿1.051 mg／mL、 白鮮堿1.012 mg／mL、 吳茱萸春堿1.036 mg／mL的溶液，精密量取適量置于25 mL量瓶中，甲醇定容，搖勻，即得 （含N-反式-對香豆酰酪胺0.025 45 mg／mL、 茵芋堿0.026 28 mg／mL、 白鮮堿 0.025 30 mg／mL、 吳茱萸春堿0.025 90 mg／mL）。

表2 水分、浸出物、灰分總灰分、酸不溶性灰分含有量測定結果Tab.2 Results of content determination of water， extract，total ash and acid-insoluble ash

圖3 各成分HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

2.3.3 供試品溶液制備 精密稱取藥材粉末5.0 g，置于150 mL具塞錐形瓶中，精密加入100 mL甲醇，密塞，超聲提取30 min（40 kHz、280 W），放冷，甲醇補足減失的質量，搖勻，精密移取20 mL，水浴蒸干，甲醇溶于10 mL量瓶中并定容，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.3.4 線性關系考察 精密量取 “2.3.2”項下對照品溶液，甲醇按一定比例進行稀釋，在“2.3.1”項色譜條件下進樣測定。以溶液質量濃度為橫坐標 （X），峰面積為縱坐標 （Y）進行回歸，得N-反式-對香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿回歸方程分別為Y＝137.96X＋0.118 7（r＝0.999 7）、 Y＝1 081.5X＋0.950 3（r＝0.999 8）、Y＝1 775.1X－1.335 8 （r＝0.999 8）、 Y＝1 586.2X＋1.193 （r＝0.999 8）， 分別在 0.002 036～0.203 6、0.002 102～0.210 2、 0.002 024～0.202 4、0.002 072～0.207 2 mg／mL范圍內線性關系良好。

2.3.5 精密度試驗 取S10樣品，按 “2.3.3”項下方法制備供試品溶液，在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得N-反式-對香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿峰面積RSD分別為1.71%、1.83%、1.81%、0.47%，表明儀器精密度良好。

2.3.6 重復性試驗 取S10樣品，按 “2.3.3”項下方法制備6份供試品溶液，在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定，測得N-反式-對香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿含有量RSD分別為1.91%%、1.60%、1.83%、0.68%，表明該方法重復性良好。

2.3.7 穩定性試驗 取 “2.3.6”下供試品溶液，在 “2.3.1” 項色譜條件下于 0、 2、 4、 8、 12、24 h進樣測定，測得N-反式-對香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿峰面積 RSD分別為1.34%、1.26%、1.84%、0.49%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 取含有量已知的S10樣品，分別精密稱取2.0、2.5、3.0 g，各3份，精密加入甲醇溶解的對照品溶液100 mL（按藥材原有量的100%加入對照品），在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算回收率，結果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結果 （n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.3.9 樣品含有量測定 取S1～S20樣品，按“2.3.3”項下方法制備供試品溶液，平行2份，在 “2.3.1”項色譜條件下進樣測定，計算含有量，結果見表4。

3 討論

3.1 TLC耐用性考察 本實驗考察了TLC法在低溫 （4℃）、常溫 （25℃）、低濕 （32%）、高濕（88%），以及不同廠家薄層板條件下的耐用性。結果顯示，該方法在不同溫度、濕度條件下斑點清晰，分離度良好；在不同廠家薄層板上均有良好分離效果，以德國默克公司生產者最優。

表4 各成分含有量測定結果Tab.4 Results of content determination of various constituents

3.2 供試品提取方法和色譜條件考察 本實驗考察了水、50%乙醇、乙醇、50%甲醇、甲醇，以及超聲、回流提取15、30、45 min對三叉苦提取效果的影響，發現甲醇超聲30 min時提取完全，而且操作簡單?？疾鞕z測波長時，選擇藥材中含有量較高的生物堿作為對象，DAD檢測器在200～400 nm波長范圍內進行全波長掃描，發現各成分最大吸收波長分別為吳茱萸春堿244 nm、白鮮堿237 nm、茵芋堿 248 nm、N-反式-對香豆酰酪胺290 nm，綜合考慮，選擇240 nm作為檢測波長?？疾炝鲃酉鄷r，選擇甲醇-磷酸、乙腈-磷酸、甲醇-甲酸、乙腈-甲酸，以及0.05%、0.1%、0.2%磷酸、甲酸，發現以乙腈-0.1%磷酸為流動相時分離效果良好，干擾成分少。考察色譜柱適用性時，選擇Ecoil HPLC C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm）、 Waters Xselect HSS T3 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）、CAPCELL PAK MGII C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），發現以乙腈-0.1%磷酸為流動相時三者均可達到良好分離效果。

3.3 限量指標確定 本實驗發現，20批三叉苦中N-反式-對香豆酰酪胺、茵芋堿、白鮮堿、吳茱萸春堿含有量差異較大，平均值分別為0.018 0%、0.010 1%、0.010 6%、0.020 8%，即以吳茱萸春堿含有量最高。為了便于控制藥材質量，選擇吳茱萸春堿作為限量指標，并建議其含有量不得低于0.015% （按干燥品計算）。

3.4 水分、灰分、酸不溶性灰分、浸出物限度確定 本實驗發現，20批三叉苦中水分、總灰分、酸不溶性灰分平均含有量分別為5.84%、1.12%、0.06%，并建議三者分別不得超過8.0%、1.5%、0.1%。再考察水、稀乙醇、95%乙醇，以及冷浸法、熱浸法對浸出物含有量的影響，發現稀乙醇提取效果最好，冷浸法、熱浸法無明顯差異，浸出物（冷浸法）平均含有量為5.05%，并建議其不得低于4.0%。