大豆分離蛋白-花青素復合乳液穩定性研究

朱 穎 趙思明 安 然 張雪娜 王中江 江連洲

(東北農業大學食品學院， 哈爾濱 150030)

0 引言

大豆分離蛋白(SPI)作為一種營養價值豐富的食用蛋白資源，因其較高的蛋白含量以及優良的功能特性，如凝膠性、乳化性、起泡性及持水性等，而被廣泛應用于食品加工中[1-3]。食品加工過程中，熱殺菌、改性等環節都會采用熱處理這一處理手段[4]。熱處理具有殺菌、抑制酶活性、改善食品感官品質等功能，但過度加熱也會破壞熱敏性營養成分(如維生素)，使感官品質劣化。此外，熱處理可顯著影響蛋白質的結構，適當的熱處理能使蛋白變性，增強蛋白質水解度。熱處理導致蛋白質的伸展，表面疏水性增加，二硫鍵交聯形成聚集體，同時會暴露一些疏水基團參與聚集體的形成[5]。

花青素作為一種黃酮類含量豐富、廣泛應用于食品中的植物色素，其可清除DPPH自由基，具有很強的抗氧化作用[6]，可延緩衰老。此外花青素還具有抑菌、預防癌癥、抗心血管疾病等多種功能[7-9]。花青素是一種小分子活性物質，具有較強的蛋白親和性，可通過滲入到蛋白微原纖間，與多肽鏈形成多種交聯點[10]。

近年來，蛋白與多酚間的研究主要集中在二者的結合機理及二者復合后對蛋白結構和功能性質的影響等方面。HE等[11]研究發現，β-乳球蛋白和錦葵花素葡萄糖苷通過疏水相互作用發生結合，導致蛋白質二級結構發生變化。KANAKIS等[12]采用分子模擬的方法發現，茶多酚和乳球蛋白通過疏水相互作用結合。PRIGENT等[13]使用等溫滴定量熱法研究牛血清白蛋白(BSA)與原花青素的作用機理發現，二者通過氫鍵發生結合。JIA等[14]在堿性條件下研究乳清蛋白和表兒茶素的相互作用，發現表兒茶素的加入改變了乳清蛋白的二級、三級結構，且蛋白的起泡性和乳化性均得到改善。

本文研究SPI-花青素復合溶液在熱處理條件下其復合乳化體系的功能性質、界面性質、理化性質及微觀結構的表征，利用動態光散射、乳化穩定性等宏觀指標，明確SPI與花青素間的互作關系對乳液性質的影響規律；同時通過氧化穩定性實驗，探究花青素濃度對復合乳液氧化穩定性的影響，進一步探討花青素對大豆分離蛋白理化性質的影響，為開發新的大豆蛋白產品提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆分離蛋白，實驗室自制；花青素(質量分數為25%)購自陜西天之潤生物科技有限公司，進一步經過固相萃取分離純化，除去蛋白質、多糖、有機酸和酚類物質，得到的花青素純化物質量分數提高到 35%；鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉，北京新光化工試劑廠；正己烷、乙酸乙酯、甲醇，天津北科化學品有限責任公司；其他化學試劑均為分析純試劑。

1.2 儀器與設備

GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機，上海盧湘儀離心機儀器有限公司；FD5-3型冷凍干燥機，美國SIM公司；PHSJ-4A型實驗室pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；電子分析天平(0.000 1 g)，北京賽多利斯儀器系統有限公司；ULTRA-TURRAX UTL2000型乳化機，德國IKA儀器設備公司；F-4500型熒光分光光度計，日本HITACHI公司；TU-1800型紫外可見分光光度計，鄭州飛旭光譜儀器有限責任公司。

1.3 實驗方法

1.3.1大豆分離蛋白制備

參考MEINLSCHMIDT等[15]的方法。將新鮮大豆碾碎成粉后，與正己烷按照液料比3 mL/g 的比例混合，室溫(20℃)下攪拌2 h進行3次脫脂。將脫脂豆粉與去離子水按照液料比10 mL/g混合后，用NaOH(2 mol/L)將溶液的pH值調節至8.5，室溫下攪拌2 h后，溶液9 000g離心20 min，取上清液用HCl(2 mol/L)將溶液pH值調節至4.5。溶液靜置2 h后6 000g離心20 min得到蛋白沉淀，最后將蛋白沉淀溶于去離子水，用NaOH(2 mol/L)將蛋白質pH值調節至7.0。將蛋白溶液冷凍干燥后得粉末狀大豆分離蛋白。

1.3.2花青素提純

參照SUI等[16]的方法，將富含花青素的黑米提取物粉末溶于去離子水，使用固相萃取技術去除黑米提取物中雜質。具體純化步驟為，首先用2倍體積的酸化水去除不溶性成分，如糖、酸等，然后用2倍體積的乙酸乙酯去除多酚類化合物，如酚酸、黃酮等，最后用甲醇洗脫吸附在吸附柱上的花青素。使用旋轉蒸發器在40℃條件下除去甲醇，即可得純化后的花青素，在-20℃條件下貯存，直至使用。在280 nm處使用高效液相色譜法檢測花青素的純度。

1.3.3大豆蛋白-花青素乳液制備

取30 mL的85℃熱處理SPI溶液(0.1%)，按照蛋白與花青素質量比100、80、60、40、20加入花青素，室溫下磁力攪拌30 min后，加入10 mL牡丹籽油充分混合均勻，并加入0.2 mg/mL疊氮鈉防止溶液變質。使用高速剪切法制備乳液，將溶液在均質機上以16 000 r/min的轉速分散2 min，且每隔30 s停頓一次。將未加花青素的乳液記為0號樣品，按照蛋白與花青素的質量比從大到小依次將乳液記為1、2、3、4、5號樣品。

對于經濟發展指標，實證檢驗中通常采用人均收入水平，但Stern[13]認為，收入不是均勻分布的，收入高出人均水平的人遠遠少于人均水平的人，因此，不應用人均收入作為經濟發展的變量，而應采用收入水平的中位數。

1.3.4乳液動態光散射測定

使用Mastersizer 2000型激光粒度儀對樣品溶液進行粒徑分布測定。顆粒折射率1.46，分散劑折射率1.33，吸收參數0.001[17]。

1.3.5乳液表面靜電荷測定

參考ZISU等[18]的方法采用Zeta電位儀測定樣品的ζ-電位，上樣體積為1 mL，測定溫度為25℃，溫度平衡時間為2 min。

1.3.6乳液乳層析指數測定

參考MORALES等[19]的方法測定乳層析指數。室溫條件下將制備好的樣品靜置7 d，每天同一時刻記錄乳液在比色管分層界面的刻度，用以衡量乳液分離的程度。乳層析指數的計算公式為

B=HC/HE×100%

式中HC——清液高度

HE——乳液總高度

1.3.7乳液蛋白吸附率測定

參考LIANG等[20]的方法測定復合乳液蛋白吸附率。將新鮮樣品在12 000g的條件下離心45 min，使樣品乳液分層。將底部清液小心取出，使用0.45 μm濾膜過濾后，使用凱氏定氮法測定濾膜過濾后的蛋白質量比CSER。蛋白吸附率的計算公式為

P=(CINI-CSER)/CINI×100%

式中CINI——最初乳液中總的蛋白質量比，g/g

CSER——上清液中的蛋白質量比，g/g

1.3.8乳液抗氧化性測定

(1)DPPH自由基清除率

參照LIU等[21]測定的方法并稍作修改。將DPPH溶于乙醇中制成100 μmol/L的溶液，取2 mL該溶液加入到2 mL的樣品中，在室溫下將反應混合物搖動混勻，并在黑暗環境中放置30 min。測定其在517 nm處的吸光度作為空白。自由基清除活性以DPPH變色百分比計算，DPPH自由基清除率公式為

式中A0——空白樣品的吸光度

Ai——在不同測試樣品存在下的吸光度

Aj——空白試劑的吸光度

(2)ABTS+·清除率

根據CHEW等[22]所述方法進行實驗并稍作修改。將7 mol/L的ABTS+溶液加入到2.45 mol/L的過硫酸鉀水溶液，在室溫下避光12～16 h。靜置12 h處理后用磷酸緩沖鹽溶液(PBS)稀釋至在734 nm處吸光度為0.70±0.02。添加0.2 mL的樣品溶液到3.8 mL稀釋后的ABTS+溶液中后靜置6 min，測定在734 nm處的吸光度。在空白樣品中，使用0.2 mL水代替樣品。ABTS+·清除率計算公式為

1.3.9數據統計及分析

所有的實驗至少進行3次，利用SPSS Statistics軟件對數據進行ANOVA差異顯著性分析。采用Origin 9.1軟件、PeakFit 4.12分析軟件對數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 流體動力學半徑及其分布測定結果

粒徑分布可以評價花青素復合后乳液的穩定性，粒徑D可以衡量熱處理SPI-花青素復合乳液的油滴尺寸，進而評價乳液的乳化性[23]。

本實驗探究6種乳液樣品的粒徑分布及大小。圖1(圖中粒徑單位為μm)為熱處理SPI-花青素復合乳液的粒徑分布情況。由圖1可知，所有復合乳液均呈現為雙峰分布，但峰值均不同。在熱處理SPI-花青素復合乳液的樣品中，與0號樣品相比，1～5號樣品與其均有明顯差異，且有向小粒徑方向移動的趨勢，這表明花青素的加入可以改善復合乳液的粒徑分布情況。在橫坐標長度上，所有樣品中4號樣品(蛋白與花青素質量比為40)的粒徑分布范圍最窄，表明其具有更好的穩定性。

圖1 熱處理大豆分離蛋白-花青素復合乳液粒徑分布Fig.1 Droplet size distribution of heated SPI-anthocyanins hydrolysates emulsion

圖2 熱處理大豆分離蛋白-花青素復合乳液D4,3Fig.2 D4,3 value of heated SPI-anthocyanins hydrolysates emulsion

6種復合乳液的D4,3(D4,3表示體積平均粒徑)結果如圖2所示，經過花青素復合的復合乳液(1～5號樣品)其D4,3值明顯低于未復合花青素的乳液(0號樣品)。且隨著花青素添加量的增加，熱處理SPI-花青素復合液的D4,3變化趨勢為先減小后增大。其中0號樣品具有最大的D4,3，為16.20 μm，4號樣品具有最小的D4,3，為8.16 μm。5號樣品與4號樣品相比D4,3略有增加，為10.20 μm，可能是由于靜電斥力的減弱，二者之間具有吸引力減弱，從而使粒徑增大，這與實驗中乳液乳化活性的變化規律相一致。BARTOLOME等[24]研究發現，低分子量酚類的加入可以改善牛血清白蛋白的粒徑大小，從而改善乳液的液滴分布，與本文研究結果一致。

2.2 ζ-電位測定結果

ζ-電位的測定對于復合乳液穩定性的評價有著重要的意義。復合花青素后乳液的電位如圖3所示。在所有乳液樣品中，在未加花青素的條件下(0號樣品)ζ-電位絕對值最低，ζ-電位約為-15 mV。復合花青素后的乳液樣品的ζ-電位絕對值增大。當蛋白與花青素的質量比為40(4號樣品)時，乳液的ζ-電位絕對值最大，ζ-電位約為-25 mV。然而，當蛋白與花青素的質量比為20(5號樣品)時，樣品ζ-電位絕對值反而有所降低，但其絕對值仍高于0號空白樣品(花青素添加量為0)。這可能是由于花青素的添加導致蛋白質的結構發生變化，產生的靜電斥力增大，使乳液的ζ-電位絕對值增大，此外由于蛋白與花青素的結合，使蛋白內本身的正電荷與帶負電的花青素發生結合，從而使負電荷增多[25]。但是當花青素添加量較多時(5號樣品)，乳液的ζ-電位絕對值變小，這可能是因為花青素添加量過多，熱處理SPI與花青素無法發生較好的相互作用，從而增加了正電荷的暴露所導致的。ζ-電位的實驗結論與復合乳液的乳化穩定性的結論吻合。由此可以說明花青素的加入能夠改變復合乳液的ζ-電位，從而改善復合乳液的乳化性[26]。

圖3 熱處理大豆分離蛋白-花青素復合乳液ζ-電位Fig.3 ζ-potential of heated SPI-anthocyanins hydrolysates emulsion

2.3 乳層析指數分析

乳層析指數是指在儲存過程中乳液中水相和油相的分離或者聚集的程度，從而評價乳液的平衡穩定性[27]。

圖4為熱處理SPI-花青素復合乳液的乳層析指數。所有復合乳液在經過7 d的儲存后都出現了分層現象。未經花青素復合的乳液(0號樣品)具有最高的乳層析指數(CI值)，最大的CI值即為其穩定性最差。通過前期觀察發現，未加入花青素的復合乳液(0號樣品)在儲存1 d后就發生了分層，這是因為未加入花青素的乳液水油不平衡而引起油脂上浮[28]。與空白樣品(未加入花青素樣品)相比，經過花青素復合的熱處理SPI-花青素復合乳液其CI值較低，具有更好的乳液穩定性。所有樣品中4號樣品(蛋白與花青素的質量比為40)具有最低的CI值(41%)，說明在所有花青素復合的熱處理SPI-花青素復合乳液中，其具有最好的穩定性。該CI值的結果與之前實驗研究的乳化穩定性結果一致[29]。這說明熱處理SPI-花青素復合乳液的形成可以很好地阻止油相和水相的分離，防止復合乳液出現油脂上浮，從而提高復合乳液的儲存穩定性。另外花青素的復合使乳液的負電荷增多，可以有效阻止乳液發生分層，油滴之間具有充足的排斥力[30]。在乳液中，熱處理SPI吸附在牡丹籽油表面，可以有效阻止復合乳液發生分層，且花青素的復合會改變熱處理SPI的結構，使花青素與熱處理SPI發生緊密的結合，進而提高復合乳液的穩定性。

圖4 熱處理SPI-花青素共建復合乳液的乳層析指數Fig.4 Emulsion creaming index of heated SPI-anthocyanins hydrolysates emulsion

2.4 界面蛋白質量濃度測定結果

花青素復合后熱處理SPI-花青素復合乳液的界面蛋白質量濃度如圖5所示，界面蛋白質量濃度由1.3.7節中的蛋白吸附率與比表面積的比值獲得，比表面積由Mastersizer 2000型激光粒度儀測得。

圖5 熱處理SPI-花青素復合乳液界面蛋白質量濃度Fig.5 Protein concentration of heated SPI-anthocyanins hydrolysates emulsion

由圖5可知，經過花青素復合的乳液其界面蛋白質量濃度呈現先上升后下降的變化趨勢，但與空白樣品相比其界面蛋白質量濃度均提高。通常乳液的界面蛋白質量濃度會決定熱處理SPI吸附至油-水界面的能力。1～4號樣品隨著花青素添加量的不斷增加，復合乳液界面蛋白質量濃度從4.76 mg/m2提高至8.29 mg/m2，而未經熱處理的樣品界面蛋白質量濃度為1.75 mg/m2。該結果說明適宜的花青素復合比例可以導致熱處理SPI的結構舒展，從而使熱處理SPI更好地吸附到乳液的油-水界面。同時花青素與熱處理SPI相互作用后也可以吸附在乳液的油-水界面，從而形成雙乳化層。因此復合乳液的界面蛋白質量濃度增加。當蛋白與花青素的質量比為20(5號樣品)時，乳液界面蛋白質量濃度相比于4號樣品時略有降低，為6.36 mg/m2，但仍高于空白樣品(0號樣品)，可能是由于花青素的添加量過大，花青素與熱處理SPI間相互作用出現不溶性的聚集體，從而使吸附于油-水界面的蛋白及蛋白-花青素復合物脫離。以上結果說明熱處理SPI-花青素復合乳液中蛋白吸附界面的能力與花青素的添加量有關[31]。

2.5 氧化穩定性測定結果

花青素對熱處理SPI抗氧化性影響如圖6所示，由圖6可知，隨著花青素添加量的增加，乳液DPPH自由基和ABTS+·清除率先上升后略有下降，但1～5號樣品均要好于0號樣品，這可能是由于花青素自身具有抗氧化性，與熱處理SPI發生相互作用后形成復合物具有花青素所攜帶的抗氧化性，另一方面，SILVESTRE等[32]研究發現，水包油型乳液的氧化性受包裹脂質的界面膜性質的影響，乳化液滴界面厚度是影響乳液態食品抗氧化性的重要因素。因此熱處理SPI與花青素在乳液界面形成韌性及機械強度較好的界面膜是乳液具有良好抗氧化性的重要因素。因而對于1～4號樣品，隨著花青素添加量的增多，其復合乳液抗氧化性不斷提高。但繼續增加花青素添加量(5號樣品)，其復合乳液抗氧化性較4號樣品有所降低，但仍高于空白樣品。這可能是由于當花青素添加量較多時，花青素與熱處理SPI作用生成不溶性聚集體，從界面膜上游離，從而使界面膜機械強度降低，進而導致復合乳液的抗氧化性有所下降。根據此實驗結果發現，花青素的添加能夠提升復合乳液的抗氧化性。DUBEAU等[33]研究牛奶對茶葉樣品抗氧化能力，發現不同方法測定的研究結果相互矛盾，通過ABTS法發現牛奶降低了茶葉的抗氧化能力。相比之下，脂質過氧化法(LPO)結果表明，牛奶可顯著提高茶葉的抗氧化性。由此發現牛奶對茶葉的抗氧化性具有雙重效應，在溶液或者固-液界面中起到抑制作用，在水包油乳液中具有增強作用，與本實驗結果相符。

圖6 熱處理SPI-花青素復合乳液的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activities of heated SPI-anthocyanins hydrolysates emulsion

3 結論

(1)利用動態光散射從宏觀角度評價花青素復合對復合乳液粒徑大小以及分布上的影響。花青素復合后，復合乳液的粒徑變小，這是由于靜電斥力的增強，蛋白與花青素之間具有更大的吸引力，發生了緊密的縮合從而使粒徑變小，這與實驗中乳液乳化活性的變化規律相一致。

(2)采用乳化穩定性、乳層析指數和ζ-電位分析，分別從不同的視角評價復合乳液的穩定性。花青素復合后，乳液的乳化性上升，乳層析指數顯著降低，ζ-電位的絕對值增加，說明乳液液滴間的靜電斥力大，不易發生聚集。所有樣品中4號樣品具有最低的CI值(41%)和最大的電位絕對值，說明在所有花青素復合的熱處理SPI-花青素復合乳液中，其穩定性最佳。

(3)乳液氧化穩定性實驗結果表明，隨著花青素濃度的增加，乳液DPPH自由基和ABTS+·清除率先上升后略有下降，其中蛋白與花青素的質量比為40時乳液抗氧化性最佳。由此可知，花青素的添加可以有效提高復合乳液氧化穩定性。