BK通道抑制劑對人臍帶華通膠來源的間充質干細胞的增殖、凋亡及細胞因子的影響

宋阿會 佟琰 劉英莉

間充質干細胞（MSC）是一類具有多向分化和自我更新能力的細胞，大量研究證明了間充質干細胞在各種疾病治療中的作用，尤其是可以通過自分泌和旁分泌等作用參與免疫疾病的調控[1-2]。MSCs能夠通過分泌細胞因子（如TGF-β、PGE2等）抑制T細胞增殖，促進Th1細胞向Th2細胞轉化，影響B細胞成熟和抗體產生等，參與機體的固有免疫和適應性免疫，也能夠促使髓樣細胞分化，從而發揮抗炎和免疫負調控的作用[3]。最近研究表明，人臍帶華通膠來源的間充質干細胞 （Human umbilical cord Wharton's jelly derived mesenchymal stem cells，WJMSC）與BMSC具有類似的形態和細胞表型[4]，但WJ-MSC表達的HLA-ABC分子較少，免疫原性更低，且來源于丟棄的臍帶，不受倫理限制，更有希望應用于各種疾病的治療[5]。

大電導鈣依賴性鉀（BK通道）分布于神經元、各脈管系統、腎小球、腎小管等細胞膜上[6-8]，參與血壓調控，神經遞質釋放，維持鉀離子平衡等生理活動[9]。BK通道是由α亞基單獨或聯合不同類型的β亞基組成的G蛋白偶聯的跨膜蛋白，包含感應膜電位的電壓敏感性跨膜域（Voltage sensing domain，VSD），結合鈣離子的胞質內域（Cytosolic domain），以及負責鉀離子內流的門孔通道功能域（Pore gate domain，PGD）[8]。研究發現，BK通道也參與各種炎癥的調節作用，如哮喘疾病中BK通道激活劑能夠減輕氣道反應[10]；同樣，BK同道還參與IL-1b誘導的單核細胞和內皮細胞的黏附[11]，有望成為炎癥治療的靶點。此外，有研究已經在BMSC上發現了BK通道的表達和活性，且發現BK通道活性能夠影響BMSC的增殖和分化能力[12]。但是，目前尚無研究證實BK通道活性對WJ-MSC的細胞活性和凋亡的影響，以及是否影響WJ-MSC分泌細胞因子。本研究嘗試探索BK通道抑制劑預處理WJ-MSC后對其細胞活性和凋亡的影響，并通過檢測預處理后其炎癥因子（IL6，IL10）的表達，探究BK通道抑制劑是否影響WJMSC的旁分泌作用，明確BK通道抑制劑對WJMSC的免疫特性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和耗材

αMEM培養基（Hyclone，美國），胎牛血清（Bioind，以色列），青霉素和鏈霉素（Gibco，美國），0.25%胰蛋白酶（Gibco，美國），CCK－8檢測試劑盒（Rainbio，上海睿安生物科技有限公司），Annexin-V-FITC/PI試劑盒（BD，美國），Elisa檢測試劑盒（Bioligand，美國），PBS溶液（Hyclone，美國），Hanks溶液（Gibco，美國），Paxilline（Alomone，美國），電轉液、電泳液（生工生物工程有限公司，中國），BKα抗體（Alomone，美國），GAPDH抗體（Proteintech，美國），RIPA（碧云天，中國），蛋白磷酸酶抑制劑混合物（索萊寶，中國）。

超凈工作臺、細胞培養箱（Thermo，美國）；多功能酶標儀（BioTek，美國），流式細胞分析儀（Beckman，美國），電泳儀（Bio-Rad公司，美國）；超敏化學發光成像系統（GE公司，美國）。

1.2 細胞培養和預處理

1.2.1 原代細胞的分離培養

經孕產婦知情同意，取其剖宮產分娩時舍棄的新鮮臍帶組織（標本來源于上海市第一婦嬰保健院），裝入事先預冷的含有1%青霉素和鏈霉素的PBS溶液中。將臍帶組織以PBS洗滌數次，去除血液后移至Hank's溶液中，去除兩條臍靜脈和一條臍動脈，剝離外皮，暴露中間的膠凍樣的華通膠，剪成小段。將剪成段的華通膠移入空培養皿中，晾干，將其剪至1 mm3大小，用勺子將其鋪至T75培養瓶底部，反轉培養瓶，在組織塊對側加入10 mL含有10%胎牛血清和1%雙抗的αMEM培養基，于37℃培養箱中過夜。8～16 h后，將培養瓶反轉使培養基漫過組織塊，繼續培養約2周。至組織塊周圍有細胞爬出時，去除組織塊，用0.25%胰蛋白酶消化約30～60 sec，中止消化后1 000 r/min離心5 min，重懸后接種至新培養皿中，每3天換一次液。取第3～7代細胞用于后續實驗。

1.2.2 WJ-MSC預處理

取第3～7代WJ-MSC細胞，以106個/孔接種至6孔板，待其生長至80%融合時加入不同濃度的Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）孵育24 h，取上清或細胞用于后續檢測。

1.3 Western－b lot檢測BK通道的表達

取第3～7代WJ-MSC細胞，以106個/孔接種至6孔板，待其生長至80%融合時去除上清，加入RIPA和蛋白酶磷酸酶抑制劑混合物配置的裂解液，裂解細胞，用BCA法定量各組蛋白濃度后，加入適量5×loading buffer，100℃煮10 min。配置8%的SDSPAGE膠，將3個不同來源的臍帶華通膠間充質干細胞所提取的蛋白樣品在上樣前100℃煮5 min，以80 V恒壓電泳至染料達膠底部，220 mA恒流轉膜2 h，膜在5%脫脂牛奶中室溫封閉2 h，加入一抗，4℃過夜孵育8～16 h，TBST洗3次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗3次后顯色。Image J軟件分析灰度值。

1.4 瓊脂糖凝膠電泳檢測編碼BK通道的KCNMA1基因表達

采用TRIzol法提取第3～7代細胞總RNA，利用Prime Script RT Master Mix （Takara036A）將RNA逆轉錄為cDNA，采用PCR法擴增KCNMA1基因，所得產物在1.5%的瓊脂糖膠中進行電泳。KCNMA1基因正向引物序列為：5’-GGCAGCAGTCTTAGAATGAGTAG-3’；反向引物序列為：5’-AAAGCCCACCACATGCGTT-3’。

1.5 CCK－8法檢測細胞活性

細胞預處理后，各孔加入10μL CCK－8，37℃孵育4 h后，用微孔酶標儀檢測各孔在450 nm處的吸光度值。

1.6 Annexin-V-FITC/PI檢測細胞凋亡

細胞預處理后，用0.25%胰蛋白酶消化各孔細胞，取一組空白組作為空白對照，其余各孔細胞消化后1 000 r/min離心5 min，棄上清，用100μL Annexin Buffer重懸后加入4μL AnnexinV，避光孵育10 min，加入4μL PI后立即上機檢測。

1.7 Elisa法檢測細胞因子

取細胞預處理后的上清，按照Elisa試劑盒步驟依次檢測各組IL6、IL10濃度。

1.8 數據處理及統計學分析

所有實驗均用GraphPad軟件統計分析3次獨立實驗結果，計算各組間均值和標準差，多組間差異比較用ANOVA one-way檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 原代WJ-MSC上BK通道的表達

光鏡觀察發現，原代WJ-MSC為梭狀，似成纖維細胞，與間充質干細胞描述一致（圖1）。Westernb lot檢測顯示，3個不同來源臍帶組織的原代WJMSC提取的蛋白質，均可檢測到BK通道抗體表達（圖2）。同時，以瓊脂糖凝膠電泳在這3個不同標本來源的間充質干細胞上鑒定到了編碼BK通道的KCNMA1基因的表達（圖3），即不同來源的臍帶華通膠分離的間充質干細胞均有BK通道的表達。

圖1 光鏡下原代WJ-MSC形態Fig 1 The morphology of primary WJ-MSC cells under optical microscope

圖2 不同標本來源WJ-MSC中BK通道的表達Fig.2 The protein expression of BK channel in different WJ-MSC was detected

圖3 不同標本來源WJ-MSC中編碼BK通道的KCNMA1Fig.3 The gene KCNMA1 encoding BK channel in WJ-MSC

2.2 不同濃度Paxilline對WJ-MSC活性的影響

不同濃度Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）處理WJ-MSC 24 h后，用CCK-8試劑盒檢測各組在450 nm處的吸光度值。結果顯示，低濃度的BK通道抑制劑Paxilline對細胞活性沒有明顯影響，而高濃度Paxilline（1μM、10μM）可顯著降低細胞活性（P<0.01）（圖4）。

圖4 CCK-8法檢測不同濃度BK通道抑制劑對WJ-MSC活性的影響Fig.4 The cell viability of WJ-MSC was detected by CCK－8 after treated with different

2.3 不同濃度Paxilline對WJ-MSC凋亡的影響

不同濃度Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）處理WJ-MSC 24 h后，收集細胞上清及細胞，通過Annexin-V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡情況。結果顯示，高濃度Paxilline（10μM）可明顯增加Annexin-V單陽細胞的比例，促進WJ-MSC細胞的凋亡（P<0.01），而低濃度Paxilline對WJ-MSC細胞的凋亡無明顯影響（圖5）。

圖5 流式細胞分析儀檢測不同濃度BK通道抑制劑處理WJ-MSC后凋亡細胞比例Fig.5 The cell apoptosis ratio of WJ-MSC was detected by flow cytometry after treated with different concentration of BK channel inhibitors

2.4 不同濃度Paxilline對WJ-MSC分泌IL6、IL10的影響

不同濃度Paxilline（0μM、0.1μM、1μM、10μM）處理WJ-MSC 24 h后，用Elisa檢測試劑盒檢測各組上清中IL6和IL10的濃度。結果顯示，各濃度Paxilline均能夠促進WJ-MSC分泌IL6（P<0.01），但并不增加IL10的分泌（圖6）。

圖6 Elisa法檢測不同濃度BK通道抑制劑對WJ-MSC分泌的IL6和IL10的表達Fig.6 The expression of IL6 and IL10 secreted by WJMSC was detected by Elisa after treated with different concentration of BK channel inhibitors

3 討論

大量的研究均肯定了間充質干細胞在各種疾病中存在的治療作用，亦可通過分泌細胞因子、生長因子、胞外囊泡等發揮抗炎、免疫調控等作用[2，13－14]。由于表面分子表達的差異，不同來源的間充質干細胞具備的免疫特性有所差異[15]。其中，WJ-MSC來源更原始，免疫原性更低。同時，研究還發現，通過一些干預方法預處理間充質干細胞能夠改變其免疫調節能力[16]，如使用低濃度LPS預處理MSC后，能夠增強MSC對高濃度LPS介導的凋亡的耐受作用[17]。本研究利用組織貼壁法成功從人臍帶組織中分離培養出WJ-MSC，利用Western－b lot檢測了WJ-MSC上BK通道的表達，與BMSC研究結果一致，BK通道也存在于WJ-MSC上[12]。Paxilline可選擇性抑制BK通道，在不同濃度（0μM、0.1μM、1μM、10μM）預處理下，高濃度Paxilline能夠抑制WJ-MSC的細胞活性，促進其凋亡。表明抑制BK通道活性能夠降低WJ-MSC的細胞活性，促進其凋亡。

研究表明，BK通道參與各種炎癥過程的調節，如BK通道抑制劑能夠減少LPS刺激下巨噬細胞分泌的炎癥因子（TNFα），能夠減輕胰腺炎小鼠模型中巨噬細胞炎癥反應等，但目前尚無研究探究BK通道抑制劑對WJ-MSC分泌的炎癥因子的影響。細胞因子IL6可由多種類型細胞分泌產生[18]，發揮不同的效應：①可誘導肝臟細胞合成急性時相蛋白（如C反應蛋白、血清淀粉樣蛋白A）等，啟動急性炎癥反應[19]；②作用于骨髓，可促進血小板釋放[20]；③與TGF-β共同促進CD4+的T細胞向Th17細胞分化，上調Th17/Treg細胞的比例，促進自身免疫性疾病以及慢性炎癥的發展[21]。細胞因子IL10則主要由受刺激的髓樣細胞和淋巴細胞產生[22]，能夠抑制促炎因子的分泌，增強B淋巴細胞分化及抗體的產生[23]。這兩種細胞因子的平衡有助于調節多種疾病的炎癥反應過程[18]。本研究發現，抑制BK通道后可明顯增加WJ-MSC分泌IL6的水平，但不影響其IL10的分泌。表明BK通道的活性能夠影響WJ-MSC細胞因子的分泌，進而影響其在免疫反應中發揮調節作用。

本研究存在一定的局限性。首先，還需通過細胞電生理實驗，以進一步驗證WJ-MSC上BK通道的活性；其次，針對BK通道的抑制只使用了抑制劑，或可利用shRNA敲減WJ-MSC上的BK通道后進行驗證，同時由于一直沒有探索出原代干細胞的過表達質粒構建條件，尚缺乏過表達BK通道以進一步檢驗上述結論。此外，雖然BK通道抑制劑能夠促進WJ-MSC分泌的IL6水平，但抑制BK通道后對WJ-MSC的免疫負調控作用的影響尚需進一步研究明確。