左旋丁基苯酞對血管性癡呆大鼠神經功能、線粒體氧化應激及海馬組織膠質細胞源性神經營養因子表達的影響

郭鵬

(濟南市第三人民醫院神經內科，山東 濟南 250132)

血管性癡呆(VD)多繼發于腦動脈粥樣硬化等腦血管疾病〔1,2〕，其發病機制與神經元凋亡或壞死等病理過程相關，目前尚無有效治療方法與藥物〔3,4〕。丁基苯酞(NBP)為多靶點腦保護脂溶性藥物，具有多種藥理作用〔5,6〕，其左旋體及右旋體藥效作用不同，右旋NBP(R-NBP)在調節神經細胞凋亡過程中可拮抗左旋丁基苯酞(L-NBP)；L-NBP有較強抗腦缺血損傷及抗VD作用，但其作用機制目前尚未完全闡明〔7〕。有研究結果表明，線粒體氧化應激與腦缺血后神經細胞凋亡壞死密切相關，神經細胞缺血缺氧時激活活性氧(ROS)及一氧化氮(NO)，誘導線粒體凋亡途徑，在VD發生發展過程中具有中間橋梁作用〔8〕。膠質細胞源性神經營養因子(GDNF)與神經細胞突觸可塑性及神經膠質增生、記憶沉積形成等密切相關，在營養神經細胞、參與認知功能方面有重要作用〔9〕。本研究通過觀察L-NBP對VD大鼠海馬組織GDNF表達的影響，探討L-NBP抗VD的相關作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物及分組 選擇健康雄性6月齡SD大鼠〔體重(220±20)g〕，中國醫學科學院動物實驗中心提供(許可證號：SYXK-2013-0025)。隨機分為假手術組，模型組，L-NBP組，每組20只。

1.1.2試驗藥物與試劑 L-NBP(純度99%)，購于石藥集團，使用前采用植物油稀釋10倍配制溶劑；超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)，購于南京建成生物工程研究所；二氨基聯苯胺(DAB)染色試劑盒、兔抗GDNF抗體，購于武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗，美國CST公司提供；Morris水迷宮(DMS-2)中國醫學科學院藥物研究所。

1.2實驗方法

1.2.1動物模型制備 經Morris水迷宮篩選學習記憶力正常80只大鼠，隨機選取60只按照參考文獻〔10〕方法采用永久性結扎雙側頸總動脈建立大鼠VD模型。造模6 w后應用Morris水迷宮篩選造模成功大鼠40只〔(各時段成績平均逃避潛伏期-對照組逃避時間均值)/該組大鼠平均逃避潛伏期≥20%〕，隨機分為模型組，L-NBP組(10 mg/kg)，每組20只。L-NBP組灌胃給藥10 mg/(kg·d)，連續給藥3 w，假手術、模型組給予等體積消毒豆油。

1.2.2大鼠行為學測試 主要采用定位航行及空間探索實驗。水溫(20±2)℃，水深30 cm，定位航行實驗：大鼠連續訓練5 d，記錄從入水到爬上平臺的時間，即逃避潛伏期；空間探索實驗：記錄2 min內大鼠在水池內的游泳路徑及穿過平臺位置次數。

1.2.3HE染色觀察腦組織病理形態學變化 大鼠采用 4%多聚甲醛固定，斷頭取腦，取視交叉后4 mm與小腦前部位，置于多聚甲醛中浸泡，石蠟切片包埋，蘇木素-伊紅(HE)染色，封片后光鏡下觀察。

1.2.4海馬線粒體SOD、ROS測定 處死大鼠后取腦，分離海馬組織，按照試劑盒說明書加入線粒體分離試劑A(1 ml/100 mg)制備勻漿，1 000 r/min 4℃離心5 min，取上清液4℃ 3 500 r/min離心10 min，取沉淀即為線粒體。部分加入儲存液重懸線粒體，測定相應指標；采用Western印跡方法，取線粒體重懸液，按照試劑盒說明書測定SOD、ROS水平，采用紫外分光光度計測定吸光強度。

1.2.5免疫組化法測定海馬GDNF表達 剝離大腦皮層與海馬區，組織石蠟切片，脫蠟，免疫組化法測定GDNF蛋白表達(抗體1∶1 500稀釋)，DAB顯色，復染后封片，Image-pro plus圖像分析系統分析。

1.3統計學方法 采用SPSS19.0軟件，計量資料行單因素方差分析及LSD檢驗。

2 結 果

2.1對大鼠學習記憶能力的影響 大鼠逃避潛伏期模型組>L-NBP組>假手術組(表1)，穿越平臺次數假手術組>L-NBP組>模型組(P<0.05，表2)。

2.2各組腦組織病理形態學 假手術組細胞形態正常，排列整齊，數目較多，核仁明顯；模型組細胞排列紊亂，形態不完整，數目較少，結構不正常，細胞核固縮，有增生膠質細胞；與模型組比較，L-NBP組神經元及細胞變性壞死減輕，見圖1。

表1 三組逃避潛伏期比較

與假手術組比較：1)P<0.05，與模型組比較：2)P<0.05；下表同

表2 三組穿越平臺次數比較次)

圖1 各組海馬組織CA1區病理形態學(HE染色，×20)

2.3各組海馬線粒體SOD、ROS水平比較 與假手術組比較，模型組海馬組織線粒體ROS含量明顯升高，SOD活性明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，L-NBP組線粒體ROS含量明顯降低，SOD活性明顯升高(P<0.05)。見表3。

2.4免疫組化法測定海馬GDNF表達水平 免疫組化結果陽性細胞胞質呈棕黃色，模型組陽性細胞數明顯低于假手術組，L-NBP組陽性細胞數明顯高于模型組(P<0.05)，見表3，圖2。

表3 三組海馬線粒體SOD、ROS水平及GDNF蛋白陽性表達比較

圖2 免疫組化法測定海馬GDNF蛋白表達(×400)

3 討 論

有研究結果顯示NBP可促進VD大鼠腦組織海馬區BDNF mRNA及其蛋白表達，內源性腦源性神經營養因子(BDNF)神經保護作用可顯著改善缺血腦組織損傷，但BDNF不易透過血腦屏障，NBP多靶點作用途徑提高了內源性神經保護作用〔11，12〕。治療急性缺血性腦卒中，L-NBP作用強于R-NBP，R-NBP拮抗L-NBP的抗神經細胞凋亡作用〔13，14〕。本研究結果提示應用L-NBP后VD大鼠腦組織神經功能損傷減輕，學習記憶能力改善，L-NBP對VD大鼠有一定神經保護作用。

有研究顯示，GDNF與學習記憶過程相關，GDNF與其受體酪氨酸激酶(Trk)B結合后，磷脂酶迅速水化暴露結合受體部位，再經磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)活化，信息向下傳遞，結合神經細胞外信號調節激酶(ERK)作用，信息整合傳入神經細胞內；在線粒體促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)作用下，信息整合存儲，結合鈣離子發揮生物學效應，進而調節GDNF分化轉導，GDNF信號轉導途徑中介信號為酪氨酸酶磷酸化TrkB，參與學習記憶過程〔15～17〕。本研究結果也提示L-NBP對VD大鼠有一定神經保護作用，可能通過GDNF介導的PI3K/蛋白激酶B(Akt)信號途徑，促進損傷神經元再生修復。

神經細胞缺血缺氧時激活ROS及NO，誘導線粒體凋亡途徑，在AD發生發展過程中，線粒體結構功能異常、氧化應激損傷、產生自由基增加均具有中間橋梁作用；腦組織受氧化代謝率高、抗氧化劑水平較低等因素影響，易受ROS介導損傷。線粒體為機體產生自由基的源泉，可能為ROS損傷的最早靶點，沉默信息調節因子(Sirt)3與線粒體能量代謝密切相關，可通過活化下游靶點SOD、過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α發揮線粒體保護作用〔8〕。本研究結果提示L-NBP可能通過調節SOD水平，增強清除ROS能力，調控線粒體氧化應激水平，發揮抗氧化應激作用，其具體作用途徑尚有待深入探討。