瑞芬太尼聯合臍血間充質干細胞預處理對大鼠顱腦損傷后神經功能修復的影響

王艷芝 張紅玉

(遵化市人民醫院麻醉科，河北 遵化 064200)

顱腦損傷的發生率、死亡率和殘疾率都較高〔1〕。嚴重的腦損傷即使經治療挽救了生命，但其所引發的運動、記憶及情感等后遺癥卻極大地影響患者的生活質量，給病人家庭與社會造成巨大的經濟和精神負擔〔2〕。如今臨床上多半情況下采用對癥支持、減輕腦腫脹等治療措施處置顱腦損傷。待生命指標穩固之后，再針對神經功能的缺損進行后期的功能復蘇訓練及高壓氧等醫治手段。然而神經功能缺損卻無法獲得更佳改善。如何解決此問題一直是在基礎研究和臨床實踐的重大難題〔3～7〕。干細胞(BM-MSCs)具有很強的增殖和分化能力，它已在顱腦損傷修復方面突出了不可估量的臨床應用價值〔8，9〕。然而骨髓間充質干細胞具有容易染菌，繁殖生長分化能力隨代數增多而下降，生源稀少等缺點，限定了其在臨床治療中的普遍應用〔10〕。臍血間充質干細胞(UC-MSCs)與BM-MSCs相對照，除生物學特性相似外，展示出進一步低沉的免疫原性〔11〕，且此類細胞在離體特殊待定的前提下可定向分化為神經元樣細胞〔12，13〕。瑞芬太尼是一類效果很強的阿片類鎮痛藥，因它能被迅速分解，具備半衰期短、藥物耐受性好等特性，在臨床麻醉中普遍使用〔14～18〕。研究表明，瑞芬太尼對大鼠全腦缺血再灌注(IR)損傷有修護效果〔19～22〕。本文觀察瑞芬太尼預處理結合UC-MSCs對大鼠顱腦損傷后神經功能修護的作用。

1 材料與方法

1.1動物及分組 健康成年雄性SD大鼠60只，體重180～230 g。由河北醫科大學動物實驗室實驗室供給，合格編號：1801047。所用動物和測試方法經實驗動物倫理委員會批準。遵守實驗動物使用及管理原則，及時更換墊料和飲用水，保持飼養環境清潔、恒溫，平均每籠4～5只。動物自由喝水，所用飼料切合標準，遵循日夜規律。適應性飼養1 w后。隨機分成IR組，UC-MSCs組，瑞芬太尼+UC-MSCs組(聯合組)，每組20只。IR組在IR前5 min由尾靜脈打針注入1 ml生理鹽水，UC-MSCs組由尾靜脈打針注入UC-MSCs混懸液1 ml，聯合組除了由尾靜脈打針注入UC-MSCs混懸液1 ml之外在冠狀動脈阻斷前10 min經尾靜脈打針注入瑞芬太尼10 μg/kg。

1.2主要材料及來源 主要儀器：HX300動物呼吸機(北京眾實迪創科技)，恒溫水浴鍋(江蘇金怡)，BL-420E生物機能實驗系統(安徽正華)，強生6-0 Prolene線，JT3101N電子天平(美國奧豪斯)，穩壓穩流卵白電泳儀PowerPac Basic，GSP-9160MBE隔水式培養箱(上海泰益)，HSRS001-1型心肌切片儀，熒光定量PCR儀(江蘇和創生物科技有限公司)，瓊脂糖水平電泳槽(深圳榮達信)，ImagemasterVDS掃描儀(瑞典PharmaciaBiotech)，公司低溫離心機(ZK-380型，德國)；全自動真空脫水機(LEICA-ASP300)、組織包埋機(LEICA EG1140H)、石蠟切片機(LEICA RM2135)、展片機(LEICA HI1210)：德國LEICA公司；光學顯微鏡：日本OLYMPUS BX60系統顯微鏡。主要試劑：瑞芬太尼 (批號：091207中檢所)，戊巴比妥鈉 (Sigma Chemical Co.)RT反轉錄試劑盒(江蘇和創生物科技有限公司)，SYBR Green PCR MasterMix試劑盒(上海溥博生物科技有限公司)，瓊脂糖(上海索萊寶生物技術有限公司)，蛋白提取試劑盒及二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒(碧云天生物技術研究所)；兔抗鼠膠質纖維酸性蛋白(GFAP)多克隆抗體、兔抗鼠生長相關蛋白(GAP)-43多克隆抗體(上海篤瑪生物科技有限公司)，二抗顯色試劑盒：EnVision Detection Kit基因科技(上海)有限公司產品(Code No.GK500705)，L-DMEM 培養基、胰蛋白(美國 Gibco BRL 公司產品)，胎牛血清(FBS)(Hyclone 公司產品)，TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(美國Roche公司)。

1.3膠質纖維酸性蛋白

1.3.1大鼠顱腦損傷模型的建立 采取四動脈隔斷法〔23,24〕制作大鼠全腦IR損傷模型。SD大鼠由腹腔打針注入10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉后，俯臥位禁錮在手術臺上，正常給皮毛消毒，在后脖頸中央1、2 頸椎處刺一個長度約1.5 cm 豁口，剝開頸部肌肉袒露第1頸椎雙側小孔，用灼燒的大頭針燒灼雙邊椎動脈，使其永久鎖閉，縫合傷口。1 d后同理麻醉動物，改為仰臥位，消毒表面皮膚，脖頸前中央切開豁口，撥開雙側頸總動脈并掛線，縫合傷口，正常飼養。1 d后蘇醒狀況下，把大鼠放入鼠盒，進行尾靜脈穿刺并留下靜脈套管針。予肝素(50 IU/kg)抗凝，并聯合微量泵預備注入生理鹽水和瑞芬太尼。30 min 預處置之后，頸前中心切口，撥開雙邊頸總動脈，用細小的動脈夾封鎖，形成全腦缺血模型，15 min后打開動脈夾，恢復血流縫合傷口。回籠常規喂養。

1.3.2RT-PCR檢測 Caspase-3基因轉錄情況 將80～120 mg和1 ml Trizol試劑一起電動制備均勻漿液，再經氯仿、異丙醇、乙醇等有機試劑處置后，提取總RNA，在逆轉錄酶的催化下合成cDNA。根據基因庫提供的 mRNA 序列，應用Primer Premier5.0引物設計軟件自行設計Caspase-3及陽性對照β-actin引物 。反應體系為20 μl體系：模板2.0 μl，3′上游引物0.4 μl，5′下 游 引 物0.4 μl，PCR混合物10 μl，0.1%DEPC處理水7.2 μl。反應條件如下：94℃變性2 min；94℃變性5 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸5 s，40個循環；最后，產物在72℃延伸5 min。擴增基因β-actin的引物：正義鏈為5′-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3′，反義鏈為5′-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3′，退火溫度為57℃，產物長度為211 bp。Caspase-3：正義鏈為5′-GGAAAGCATCCAGCAATAGGC-3′，反義鏈為5′-CAGCGATGACTCAGCACCTCC-3′，退火溫度為60℃，產物長度為127 bp。

1.3.3Western印跡檢測GFAP及GAP-43蛋白表達水平 實驗動物斷頭處死，在低溫下迅速剝離海馬組織并儲存在液氮中；Tis-試劑抽提海馬組織蛋白；BCA法蛋白定量；10%SDS-PAGE 凝膠電泳，加樣量為10 μg，電泳完畢后，開始蛋白質轉膜；與GAP-43 一抗(1∶10 000)、 GFAP一抗(1∶20 000)雜交反應；再將醋酸鉛膜與辣根過氧化物酶記號的山羊抗兔 IgG(1∶10 000)雜交反應1 h，在暗室進行 X-光膠片曝光、顯影和定影。然后用同一張醋酸鉛膜與內參β-actin(1∶10 000)進行雜交反應。采用YLN-2000凝膠影像分析系統解析目標條帶，目標蛋白吸光度值和內參蛋白吸光度值的比值，作為目標蛋白的相對表達水平。

1.3.4TUNEL 法檢測神經元凋亡數 ①提前用多聚賴氨酸包裹玻片；②切片正常脫白蠟；③30%H2O2室溫處理10 min，蒸餾水洗滌2 min×3；④37℃下加入蛋白酶K工作液，反應15～30 min后，PBS漂洗5 min×3；⑤加標記緩沖液20 μl/片，以保持切片濕潤。按每張切片獲得TDT和D-DIG-UTP每1 μl加入18 μl緩沖液拌勻。每張切片拭去多余的液體。將樣品置于濕潤箱，37℃2 h；⑥封閉液封閉、稀釋、DAB顯色、蒸餾水沖洗、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察。

1.3.5改良神經功能(mNSS)評分法〔25〕檢測神經功能修復情況 分別于移植術后第1、3、7、14、28天行神經功能缺損評分，主要從運動能力、感覺能力、平衡能力和異常活動方面進行評估，運動能力測試6分，感覺能力測試2分，平衡能力測試6分，反射缺陷或異常活動4分，最高18分，最差0分，分數越高神經功能缺失情況越嚴重。

1.4統計學方法 采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析。

2 結 果

2.1RT-PCR檢測 Caspase-3 基因表達 UC-MSCs組Caspase-3 基因表達水平(1.28±0.14)較IR組(1.74±0.21)明顯下調，聯合組(1.01±0.15)與UC-MSCs組比較Caspase-3 基因表達水平明顯下調(P<0.05)，見圖1。

2.2Western印跡檢測GFAP及GAP-43蛋白表達水平 與IR組比較，UC-MSCs組GFAP及GAP-43蛋白表達明顯上調，聯合組與UC-MSCs組比較，GFAP及GAP-43蛋白表達明顯上調(P<0.05)，見表1，圖2。

圖1 各組Caspase-3基因表達

組別GAP-43GFAPIR組0.74±0.110.96± 0.19UC-MSCs組1.12±0.131)1.20±0.211)聯合組1.69±0.121)2)1.95±0.111)2)

與IR組比較：1)P<0.05;與UC-MSCs組比較：2)P<0.05；下表同

圖2 各組GFAP及GAP-43蛋白表達

2.3神經元凋亡數 IR組皮質和紋狀體都可見大量腫脹壞死細胞，核溶解，碎裂較多。UC-MSCs組和聯合組部分細胞核凝固壞死，部分細胞可見核仁，未見明顯病理性改變，與 UC-MSCs組相比，聯合組凋亡細胞明顯減少，見圖3。與IR組相比，UC-MSCs組、聯合組神經元凋亡細胞比率、凋亡細胞陽性率及TUNEL陽性率都顯著降低(P<0.05)，見表2。

圖3 各組凋亡細胞比較(TUNEL，×200)

組別凋亡細胞比率凋亡細胞陽性率TUNEL陽性率IR組9.73±1.222.93±0.1229.44±7.21UC-MSCs組7.60±1.151)1.34±0.211)17.08±5.111)聯合組5.31±1.081)2)0.68±0.091)2)8.76±2.541)2)

2.4各組神經功能修復 移植后隨天數增長，UC-MSCs組和聯合組mNSS評分均明顯降低，說明經UC-MSCs移植后神經缺損均得到一定程度改善。觀察相同天數不同組間評分結果顯示，UC-MSCs組從第1天移植后神經修復效果明顯優于IR組(P<0.05)，而聯合組明顯優于UC-MSCs組(P<0.05)，見表3。

表3 不同時間點各組mNSS評分比較分)

與IR組比較：1)P<0.05；與UC-MSCs組比較：2)P<0.05；與本組前一時點比較：3)P<0.05

3 討 論

細胞凋亡是基因調控下細胞主動性死亡過程〔26～28〕。全腦IR后神經元損傷機制系種種元素彼此交錯、彼此相關的錯綜復雜的反應體系。研究表明，細胞凋亡與腦 I/R 損傷有緊密關系〔29，30〕。嚴重的長時間缺血會引發神經細胞壞死，輕度短時間缺血及再灌注會導致神經細胞發生凋零死亡〔31〕。海馬組織系與學習、記憶、行為和情緒壓力緊密接觸的一個重要領域，也系造成的組織基本結構損傷之一的主要靶器官〔32，33〕。目前已知有多種基因，如Bcl-2、Bax、p53、Caspase-3、C-myc、Fas等均與細胞凋亡有關〔34，35〕，Caspase-3屬于半胱天冬氨酸蛋白酶的一種，處于凋亡過程的下游，系促進細胞凋亡過程的一個關鍵性蛋白酶〔36〕。GFAP系存在于星形膠質細胞中的特異性糖蛋白和骨架組分之一，扮演著保護支撐神經細胞及參加代謝的角色，同時其表達的高低在某種程度上反饋了神經元的損傷程度〔37〕。當脊髓受到損傷后，各種細胞因子發揮作用，使得靜息狀態的星形膠質細胞逐漸活化，GFAP表達也隨之上調〔38〕。GAP-43系評價估計神經元軸突毀傷和重生反應的重要標識〔39〕。本文顯示，瑞芬太尼聯合UC-MSCs能顯著改善大鼠神經功能缺失狀況，且通過抑制Caspase-3 基因表達水平及上調GFAP及GAP-43蛋白白表達水平減輕神經元凋亡，從而施展修護IR損傷大腦的作用。